Les défauts d’épissage du gène CFTR !

Cas des pseudoexons (ou exons cryptiques). Les pseudoexons sont des séquences dans les introns dont les régions flanquantes contiennent des sites d’épissage reconnus par le splicéosome. Leur taille est généralement comprise entre 50 et 300 nucléotides (Hammond & Wood 2011). La plupart des pseudo-exons résultent de la création d’un nouveau site accepteur ou donneur d’épissage fort dans les séquences introniques consécutive à la présence d’une mutation. Bien que ce mécanisme soit mineur, les exons cryptiques peuvent également résulter de la création d’un point de branchement (Meili et al. 2009). La création ou la délétion de séquences régulatrices d’épissage (figure 24) a également été décrite pour affecter l’épissage normal des transcrits (Hammond & Wood 2011), en particulier par la création de nouvelles séquences enhancers permettant le recrutement de protéines SR (Dhir & Buratti 2010). C’est le cas de la mutation c.903 +469T retrouvée dans le gène MTRR qui crée un ESE au sein de l’exon cryptique, où se fixent les protéines SF2/ASF (Homolova et al. 2010). D’autre part, la présence d’un exon cryptique peut résulter de la perte d’un élément silencer telle que la séquence ISPE (Intron-Splicing Processing Element) décrite dans le gène ATM, où se fixe le complexe U1snRNP (Pagani et al. 2002). Enfin bien que peu étudié, il est également décrit que les éléments trans-régulateurs peuvent influencer l’insertion des pseudoexons (Dhir & Buratti 2010).

2.2.1.4. Les défauts d’épissage du gène CFTR !

Il est décrit qu’environ 11% des altérations totales du gène CFTR correspondent à des mutations d’épissage. Dans les introns, la proportion de substitutions définies comme variant ou potentiel variant d’épissage représentent environ 60% (voir tableau 3) de la totalité des altérations décrites dans ces régions, néanmoins ce pourcentage est sous-estimé car les régions introniques profondes sont très peu explorées et certaines altérations ne sont pas encore caractérisées.

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Les mutations du gène CFTR au niveau de séquences consensus. L’environnement nucléotidique au niveau des séquences consensus joue un rôle essentiel dans la reconnaissance de l’ARNm par le splicéosome. Ainsi, les mutations au niveau de ces régions (figure 21) impactent le processus d’épissage normal des transcrits. Parmi les mutations d’épissage décrites pour le gène CFTR, on retrouve des mutations qui affectent le site donneur

(Hull et al. 1993; Zielenski et al. 1993), le site accepteur (Hull et al. 1993) et les nucléotides

adjacents à ces sites (Highsmith et al. 1997).

Le saut de l’exon 10. Le saut de l’exon 10 qui code la partie terminale du domaine NBD1 de la protéine CFTR (Strong et al. 1993), fait l’objet de nombreux travaux. L’épissage alternatif de cet exon peut être physiologique ou retrouvé chez les patients CF (Chu et al. 1991). Il existe une relation inverse entre la longueur du tract de thymidine (T) situé dans l’intron 9 et la proportion de transcrits dépourvus de l’exon 10. En effet, la machinerie d’épissage reconnaît moins bien l’allèle T5 que les allèles T7 et T9 (Chu et al. 1993). De plus, la répétition de dinucléotides (TG)n adjacents au tract de poly T, module le saut de l’exon induit par la séquence poly T (Niksic et al. 1999; pour revue : Claustres 2005). L’identification des variants alléliques T3 et T2 confirme cette relation (Disset et al. 2005, Radpour et al. 2009). Des travaux additionnels ont mis en évidence que le recrutement des facteurs d’épissage TDP-43 et hnRNPA1/A2 au niveau de la répétition (TG)n participe au saut de l’exon 10 (Buratti et al. 2001, Buratti et al. 2005, Ayala et al. 2006).

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# Le saut de l’exon 13%#Il est décrit que des mutations exoniques (p.Asp565Gly, p.Gly576Ala) au niveau de séquences CERES (Composite Exonic Regulatory Element of Splicing), entraînent le saut de l’exon 13 (Pagani et al. 2003).

Exemple de pseudoexons du gène CFTR%! Sur le gène CFTR, les mutations c.1680-886A>G (1811+1,6kb A>G) et c.3718-2477C>T (3849 +10kb C>T) induisent l’inclusion d’un exon cryptique de 49 et 84 pb, en créant un nouveau site donneur dans les introns 12 et 22, respectivement (Chillón et al. 1995, Highsmith et al. 1994). La mutation c.3140-26A>G (3272-26 A>G) crée un nouveau site accepteur dans l’intron 19 et entraîne l’insertion d’un exon cryptique de 25 pb. D’autre part, la délétion c.1002-1110_1113delTAAG crée un motif de reconnaissance pour la protéine SRP75, ce qui entraîne l’inclusion d’un peudoexon de 101 pb dans l’intron 7 (Faà et al. 2009).

Site accepteur de type NAGNAG%

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#La mutation c.2491G>T qui entraîne la modification de l’acide glutamique 831 par un codon

stop n’est pas associée à un phénotype sévère, lorsqu’elle est présente à l’état homozygote ou à l’état hétérozygote associée à une mutation sévère. Cette substitution, qui se trouve au niveau d’un site accepteur de type NAGNAG (figure 25), permet un épissage alternatif et ainsi la présence de 3 populations de transcrits : un transcrit délété de la totalité de l’exon 15, un transcrit contenant un codon stop et un transcrit alternatif délété de 3 nucléotides générant une protéine fonctionnelle grâce à l’utilisation de ce site NANAG (Hinzpeter et al. 2010).

2.2.2. La région 5’UTR du transcrit CFTR et les uORF

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Les uORF (upstream Open Reading Frames) sont des petites séquences contenant un codon d’initiation et de terminaison, situés en amont et en phase avec l’ORF principal d’un gène. Ces séquences permettent la production de petits peptides. Il est estimé que 49% du transcriptome humain contient des uORF et leur mécanisme d’action est illustré sur la figure

26 (Barbosa et al. 2013).

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Le ribosome peut traduire (B-E) ou non

(A-C-D) l’uORF en peptide.

Si l’étape de terminaison de la traduction est efficace, les sous unités ribosomiques se dissocient et l’ORF principal n’est pas traduit (B).

Un uORF non traduit peut également interagir avec la machinerie traduction-nelle et favoriser le blocage des ribosomes

(C).

Le codon de terminaison de l’uORF peut être reconnu comme un codon prématuré et entraîner une dégradation via le NMD par un mécanisme faisant intervenir la protéine UPF1 (D).

Après la traduction de l’uORF, la sous-unité 40S du ribosome peut rester fixer à l’ARNm et ainsi permettre l’initiation de la traduction de l’ORF principal (E)

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L’étude d’un variant (c.-34C>T) identifié chez un patient atteint de bronchectasie, a montré que ce dernier induit la création d’un uORF qui chevauche l’ORF principal du gène

CFTR. Dans des modèles cellulaires, les auteurs montrent que le variant abolie l’activité

transcriptionnelle du promoteur CFTR (Lukowski et al. 2011).

Dans la séquence promotrice du gène CFTR, la présence d’un uORF associé à une structure en épingle à cheveux participe au maintien d’une faible expression du gène CFTR (Lukowski et al. 2015).

2.2.1. La région 3’UTR du transcrit CFTR !

2.2.1.1. Les miARNs !

Les miARNs sont des ARNs non codants qui participent à la répression de l’expression des gènes en se fixant sur la région 3’UTR des transcrits. De nombreuses études montrent que ces régulateurs participent à la régulation post-transcriptionnelle du gène CFTR (Megiorni et al. 2011, Gillen et al. 2011, Hassan et al. 2012, Oglesby et al. 2013)

L’importance des miARNs dans la régulation physiologique ou pathologique du gène

CFTR est davantage développée dans le chapitre 3 de ce manuscrit.

2.2.1.2. Introduction aux motifs ARE et ARE-BPs !

Les motifs ARE (AU-rich elements). Les AREs sont présents chez les transcrits ayant une faible stabilité, permettant ainsi une modification rapide du panel protéique cellulaire. Par exemple, les motifs ARE sont retrouvés dans la région 3’UTR de transcrits codant des cytokines, des molécules intracellulaires indispensables à la communication cellulaire, qui doivent être produites et dégradées très rapidement en réponse à des stimuli externes (Vlasova-St Louis & Bohjanen 2014). Les AREs sont des séquences riches en adénosines et uridines. Elles sont le site de fixation de protéines nommées ARE-BP (pour ARE-binding

protein) qui modulent la stabilité des transcrits (Barreau et al. 2005). Les gènes contenant des

AREs représentent environ 11% des gènes humains présents sur la base de données Ensembl et seulement 2 et 5% des gènes murins (rat, souris) (Halees et al. 2008). Les ARNm contenant