Cytotoxicité

2.7.1 Mesure de la cytotoxicité des rosmarinates en fonction

de la libération de la LDH

La lactate déshydrogénase est une enzyme cytoplasmique présente dans toutes les cellules de mammifères et est rapidement libérée dans le milieu extracellulaire suite à la dégradation de la membrane cytoplasmique. Plus cette quantité est importante, plus la cytotoxicité de la substance testée est élevée. La cytotoxicité a été estimée avec un kit de détection enzymatique CytoTox-ONE G7891 de la société Promega (Madison, USA) qui comporte une enzyme, la diaphorase, et trois substrats (le NAD+, le lactate et la résazurine). Le principe de la mesure repose sur la transformation dans le milieu extracellulaire du lactate en pyruvate par la lactate déshydrogénase, cette réaction étant couplée à la réduction du NAD+ en NADH (réaction 24).

Lactate déshydrogénase

(24) Lactate + NAD+ Pyruvate + NADH

Le NADH permet à la diaphorase de transformer la résazurine en résorufine qui est un composé fluorescent (λex : 560/λem : 590 nm) (réaction 25). Sa fluorescence est proportionnelle à la quantité de lactate déshydrogénase présente dans le milieu.

Les cellules sont ensemencées dans des microplaques 96 puits noirs pendant 24 heures à 37 °C, puis sont traitées avec 25 µM de chaque phénolipide pendant 24 heures. 30 minutes avant l’évaluation de la cytotoxicité, les cellules sont équilibrées à température ambiante (22 °C).

100 µL/puits de réactif CytoTox-ONE sont ajoutés, puis les cellules sont incubées à l’abri de la lumière pendant 10 minutes à température ambiante (22 °C). 50 µL/puits de solution stop sont ensuite additionnés, et la fluorescence est immédiatement mesurée (λex : 560/λem : 590 nm). Un contrôle sans cellule est réalisé sur la même microplaque pour évaluer la fluorescence du bruit de fond.

La fluorescence corrigée est ensuite calculée en soustrayant à la fluorescence sur culture cellulaire, la fluorescence du bruit de fond du milieu (équation 9).

(Eq. 9) FluoLDH corrigée = FluoLDH brute (avec cellules) - FluoLDH bruit de fond (sans cellule)

Par ailleurs, tenant compte du fait que les composés phénoliques sont susceptibles d’influencer la croissance cellulaire et donc d’abaisser la quantité de LDH libérée, une correction des valeurs est opérée en considérant la quantité totale de lactate déshydrogénase présente dans les milieux extra- et intracellulaires. Pour cela, un certain nombre de puits contenant des cellules est exposé à 2 µL d’une solution de lyse totale (solution de tampon phosphate à 10% de Triton X-100) destinée à libérer la totalité de la lactate déshydrogénase. Les puits de la microplaque dédiés à cette opération de lyse totale sont, par la suite, traités de la même manière que ceux n’ayant pas été exposés à cette solution de lyse. Le pourcentage de cytotoxicité d’un composé phénolique est obtenu en divisant la fluorescence corrigée sans solution de lyse par la fluorescence corrigée obtenue après lyse totale, le rapport étant finalement multiplie par 100 (équation 10).

(Eq. 10) Cytotoxicité = [ FluoLDH corrigée (sans solution de lyse) / FluoLDH corrigée (avec solution de lyse)] x 100

2.7.2 Cytotoxicité par cytométrie de flux

La cytotoxicité des rosmarinates d’alkyle est également déterminée en mesurant l’intégrité de la membrane plasmique. Une sonde fluorescente, l’iodure de propidium (IP), est utilisée pour évaluer la cytotoxicité des molécules (λex : 488/ λem : 585 nm). La pénétration de cette sonde dépend de l’intégrité de la membrane. En effet, plus la viabilité cellulaire est faible plus la membrane est perméable à l’IP.

La cytométrie de flux est limitée par une quantité de cellules minimales de 10 000. Ainsi, les cellules sont ensemencées sur des plaques 6 puits (3x10⁵ cellules/puits) afin d’avoir une densité cellulaire satisfaisante pour l’analyse.

Les solutions éthanoliques de l’acide rosmarinique et de ses esters à différentes concentrations (0,5 ; 2,5 ; 5 ; 10 ; 25 et 50 µM) sont diluées au millième dans le milieu de culture, puis 2 mL de ces solutions sont ajoutés sur les cellules. Les cellules sont traitées soit pendant 24 heures dans le milieu de culture supplémenté en sérum soit 2 heures dans le DMEM sans rouge de phénol ou dans le tampon Locke.

Le milieu de culture est ensuite prélevé et transvasé dans un tube conique à centrifugation de 15 mL, car les cellules mortes n’adhèrent plus au support. Puis, les cellules sont décollées par ajout de 500 µL de trypsine (0,025 µM) et transvasées dans le même tube conique qui est centrifugé à 3000 tr/min pendant 5 minutes. Le surnageant est retiré, et le culot cellulaire dilué dans 800 µL d’une solution de iodure de propidium à 27 µg/mL dans le DMEM SRP.

Finalement, les cellules en suspension sont analysées par cytométrie de flux avec le cytomètre Gallios de la société Beckman Coulter (Villepinte, France), appartenant à la plateforme MRI de l’IRB³. Pour chaque échantillon, la fluorescence de l’iodure propidium est mesurée sur 20 000 évènements (cellules).

Les résultats sont exprimés en fonction de deux paramètres : la taille des cellules (nm) et l’intensité de fluorescence de l’IP. Ainsi, une cellule est représentée par un point dont la couleur varie du bleu au rouge selon la densité cellulaire. Le bleu

représente une seule cellule, et plus le nombre de cellules augmente plus la couleur tend vers le rouge. A titre d’exemple, dans le cas des cellules traitées avec R10 à 25 µM dans le tampon Locke pendant 2 heures, la population cellulaire est divisée en trois sous-populations (figure 25). La population avec une faible fluorescence et une

taille comprise entre 200 et 300 nm correspond aux cellules vivantes. Les cellules mortes sont représentées par les deux autres populations mais à deux stades différents. Lorsque la fluorescence de l’IP est élevée et la taille des cellules est inférieure à 200 nm, les cellules sont considérées comme mortes, alors que lorsqu’elle est proche de zéro et la taille est inférieure à 100 nm, les cellules sont totalement dégradées.

Figure 25 : Cytotoxicité du rosmarinate de décyle (R10) à 25 µM dans le tampon Locke après 2 heures d'incubation