Culture des cellules et purification des thylakoides et du PSII

a) Conditions de culture

Les cellules sont cultivées dans 1L de milieu DTN (Tableau 1) dans des erlenmeyers de 3L, sous agitation continue, dans une atmosphère enrichie en CO2, à 45°C, sous lumière

continue (80 µmol de photons.m-2.s-1). La température optimale d’une culture de T. elongatus est de 55-60°C, mais du fait de la présence de cassettes de résistance non thermophiles aux antibiotiques dans certaines cultures, il a fallu abaisser cette température. Le milieu est enrichi de 0,8 mM de CaCl2, SrCl2, CaBr2 ou SrBr2 en fonction du type d’échange biosynthétique.

A B C

milieu DTN medium 40X (pour 1 L) Micronutriments (pour 1L)

Concentration finale EDTA 2Na 7,6 g H2SO4 (conc) 0,5 mL

medium 40X 1X MgSO4, 7H2O 4 g H3BO3 0,5 g

FeIII sans Cl 14,4 mM KNO3 4 g MnSO4, H2O 2,28 g

Na2S2O3 160 mM NaNO3 28 g ZnSO4, 7H2O 0,5 g

Na2SO3 160 mM Na2HPO4, 12H2O 5,6 g CuSO4, 5H2O 25 mg

NaHSO3 320 mM Na2MoO4, 2H2O 25 mg

Tricine (NaOH) 1M pH 7,6 CoSO4, xH2O 29 mg

(NH4)2SO4 0,5 M (NH4)2Ni(SO4)2, 6H2O 19 mg

micronutriments 0,5 mL pour 1 L Na2SeO4 4 mg

Tableau 1 : Composition du milieu de culture DTN. Le milieu DTN utilisé pour les cellules est celui dont la

composition est donnée dans le tableau A. Il contient deux solutions à préparer antérieurement : une solution appelée Medium 40X (tableau B) et une solution de micronutriments (tableau C). Le pH du milieu DTN et du Medium 40X est ajusté à pH 7,60-7,65 avec NaOH. Les flacons de milieu DTN sont autoclavés à 120°C durant 20 min. Après autoclave, 10 mM de NaHCO3 sont ajoutés sans modifier le pH. La pureté des produits utilisés

est toujours la meilleure disponible dans le commerce.

Le pourcentage de chlorure est inférieur à 0,001% dans le glycérol, à 0,02% dans la bétaine et à 0,005% dans le MES. La contamination en Cl- est estimée d’après les spécifications fournies par les fabricants de l’ordre de 40 µM (provenant essentiellement de la tricine).

La concentration cellulaire est estimée par mesure de la diffusion à 750 nm. Les cellules sont cultivées jusqu’à obtenir 16 L de milieu avec une densité optique (DO) comprise

entre 1 et 1,2 à 750 nm, qui mesure la diffusion. Avec une DO de cette valeur, la concentration en chlorophylle est d’environ 10 mg/L de culture.

b) Purification des thylakoides

La purification des thylakoides et du PSII nécessite l’utilisation de trois solutions tampon différentes appelées TP1, TP3 et TP4 dont la composition est donnée dans le Tableau 2.

TP1 TP3 TP4

Glycérol 10% Glycérol 10% Glycérol 10%

MES 40 mM MES 40 mM Bétaine 1 M

Bétaine 1 M Bétaine 1 M MgX2 15 mM

MgX2 15 mM MgX2 15 mM CaX2 15 mM

CaX2 15 mM CaX2 15 mM NaX 200 mM

NaX 100 mM Imidazole 300 mM

Imidazole 15 mM MES 160 mM

βDM 0.03% βDM 0.06%

Tableau 2 : Compositions des solutions tampons TP1, TP2 et TP3. Le pH de ces solutions est ajusté à pH 6,5

avec NaOH (pour TP1) et HX (pour TP3 et TP4). X représente Cl ou Br selon l’échange biosynthétique réalisé. Le βDM est ajouté après ajustement du pH et du volume.

Les cellules sont concentrées par centrifugation à 6500 rpm à température ambiante. Après un lavage à température ambiante dans du TP1, les cellules sont resuspendues dans 100 à 150 mL de TP1 auquel on ajoute 1 mM d’acide caproïque, 1 mM de benzamidine, 0,2 % de BSA et une pointe de spatule de DNAse I (pancréas bovin, Sigma). Acide caproïque et benzamidine sont des antiprotéases, et la BSA est utile pour piéger les lipides relâchés dans le milieu pour éviter qu’ils ne jouent le rôle de détergent. Les cellules sont cassées à la presse de French. Après une centrifugation à 3500 rpm pendant 6 minutes pour enlever les cellules non cassées, le surnageant contenant les protéines solubles ainsi que les membranes (dont les thylakoides) estt centrifugé pendant 25 minutes à 50000 rpm à 4°C puis resuspendus dans du TP1 à trois reprises. Le culot de thylakoides final est repris dans du TP1. Pour des mesures sur thylakoides, la concentration finale en chlorophylle est d’environ 2 mg.mL-1. Les échantillons sont conservés dans l’azote liquide dans certains cas, pour une utilisation particulière. Sinon, la purification du PSII est enchainée immédiatement.

c) Purification du PSII

Les thylakoides préparés selon le protocole précédent sont repris dans un volume total tel que la concentration finale en chlorophylle soit de 1 mg.mL-1, après ajout des produits suivants dans le TP1 : du détergent βDM (dodecyl-beta-D-maltoside) dont la concentration finale est égale à 1% pour les échantillons CaX2 et 0,8% pour les échantillons SrX2, et 100

mM de NaCl ou NaBr. La suspension est ensuite centrifugée pendant 15 minutes à 45000 rpm à 4°C, puis le surnageant est mélangé à environ 100 mL de résine ProBondTM qui a auparavant été équilibrée avec du TP1. Le mélange thylakoides solubilisés - résine est déposé sur une colonne et lavé avec au moins 5 volumes de résine à l’obscurité à 4°C avec du TP3 (composition donnée dans le Tableau 2). La vitesse d’écoulement est de 0,5 à 1 mL.min-1. Le PSII est ensuite élué avec du TP4 (composition donnée dans le Tableau 2). L’éluat est concentré et lavé une fois en utilisant des tubes Amicon Ultra-15 (Millipore) dans du TP1. Pour un volume de 16 L de culture de cellules, on obtient généralement 160 mg de chlorophylle après le cassage des cellules, et le rendement en chlorophylle après la purification du PSII est de 3 à 5 %. Le PSII est conservé dans l’azote liquide à une concentration de 1,5-2 mg.mL-1 dans du TP1.

d) Déplétion en manganèse

Les échantillons de PSII sont dilués approximativement 10 fois dans un milieu contenant 1,2 M de Tris-HCl (pH 9,2) et sont incubés à 4°C à la lumière pendant 1 heure. Les échantillons sont collectés par centrifugation (15 minutes à 170 000g)) après addition de 1,2 M de Tris (pH 9,2) contenant 50 % de polyéthylène glycol 8000 pour que la concentration finale en PEG soit de 12 %. Le culot est ensuite repris dans une solution à pH 6,5 contenant 50 % de PEG, recentrifugé puis resuspendu dans du TP1 à pH 6,5, pour abaisser le pH. Le culot final est repris dans du TP1.