Culture cellulaire

A.1.1. Lignées cellulaires et conditions de culture

Les lignées NCI-H1975, NCI-H3255, NCI-H1299, NCI-HCC827 et NCI-H358 sont des lignées cellulaires humaines d’adénocarcinome pulmonaire. Les lignées NCI-HCC827, NCI- H1975 et NCI-H3255 ont été données par le Professeur Adi F. Gazdar (Hamon Center for Therapeutic Oncology Research, Texas USA). Les lignées NCI-H1975 et NCI-H3255 expriment la substitution L858R de l’EGFR (exon 21), la lignée NCI-HCC827 exprime le mutant Del19 de l’EGFR (délétion LREA, exon 19), tandis que les lignées NCI-H1299 et NCI- H358 expriment un EGFR sauvage. La lignée NCI-H358 présente également une mutation de K-Ras et la lignée NCI-H1975 exprime la mutation de résistance aux EGFR-TKI, T790M.

Toutes les cellules sont adhérentes et sont cultivées dans du RPMI-1640 contenant de la L- glutamine (PAA) et supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF)(PAA) préalablement décomplémenté à 56°C pendant 30 minutes. Les cellules sont cultivées en atmosphère humide à 5% de CO2 et à 37°C.

A.1.2. Transfection transitoire de vecteurs plasmidiques d’expression

Nous avons utilisé le vecteur plasmidique d’expression pcDNA3.1 comme contrôle de transfection et pour cloner les séquences codantes d’intérêt. Ce vecteur contient les séquences du promoteur fort du cytomégalovirus (CMV) et un gène codant pour la protéine néomycine de résistance aux antibiotiques, permettant une sélection des cellules transfectées par la généticine sulfate (G418)(PAA) (Figure 21). Les séquences codantes pour la protéine p14ARF (pcDNA3.1- p14ARF), le mutant L858R de l’EGFR (pcDNA3.1-EGFR-L858R) ou le mutant Del19 de l’EGFR (pcDNA3.1-EGFR-Del19) ont été clonées dans le vecteur pcDNA3.1 en aval du promoteur CMV.

83| P a g e Le vecteur d’expression de la protéine STAT3 constitutivement active est marqué par une

étiquette Flag (STAT3-C Flag pRC/CMV) et provient de chez Addgene.

Les cellules sont transfectées à 50-70% de confluence, 24 heures après l’ensemencement, par l’agent de transfection X-tremGENE HP (Roche Applied Science), par le vecteur contrôle pcDNA3.1 ou les vecteurs exprimant p14ARF, l’EGFR-L858R, l’EGFR-Del19 ou l’EGFR sauvage. Pour une pétri, mélanger le volume nécessaire de vecteur pour une quantité de 1µg ou 3µg avec 1 ml de milieu OptiMEM (sans SVF, ni antibiotique) et le X-tremGENE HP à raison de 3µl pour 1 µg d’ADN. Le mélange est incubé pendant 20 minutes à température ambiante, avant d’être réparti de façon homogène dans les pétris. Pour les expériences d’immunofluorescence, les transfections ont été réalisées sur 48h. Pour les expériences de western-blotting, la G418 est ajoutée au milieu de culture à une concentration finale 800 µg/ml (à partir d’une solution stock à 100 mg/ml dans de l’HEPES 0.1M) 24 heures après la transfection et les cellules transfectées sont ainsi sélectionnées pendant 6 jours.

Aux termes de cette sélection, les cellules sont lavées au PBS 1X (Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline, sans calcium, ni magnésium, PAA) avant d’être trypsinées (trypsine 1X obtenue à partir d’une solution stock de tryspine-EDTA 10X, 0.5%/0.2% dans du PBS, PAA). Les cellules viables sont dénombrées après coloration au bleu Trypan (Invitrogen) avec le conteur automatique de cellules (Countess, Invitrogen). Le culot cellulaire est ensuite divisé pour réaliser une extraction des protéines (voir Matériels & Méthodes, paragraphe A.3), une extraction d’ARN (voir Matériels & Méthodes, paragraphe A.2) et /ou un marquage de la

Figure 21 : Représentation du vecteur plasmidique d’expression pcDNA3.1 (Invitrogen)

84| P a g e

Tableau 6: Séquences des siARN utilisées au cours des études.

caspase 3 active pour l’étude de l’apoptose en FACS (voir Matériels & Méthodes, paragraphe

A.4).

A.1.3. Transfection transitoire d’ARN interférents

Nous avons défini les séquences qui ciblent des séquences codantes des gènes humains de p14ARF, de PTP-RT, de l’EGFR et de ses mutants l’EGFR-L858R et l’EGFR-Del19 (Tableau

6). Pour neutraliser spécifiquement l’expression de p14ARF, nous avons déterminé une séquence de siARN ciblant l’exon 1β. Les siARN sont synthétisés par Eurogentec et repris dans un volume donné d’eau RNAse-free pour obtenir une concentration finale de 100 µM. Les siARN de STAT3 proviennent de chez Invitrogen (Validated Stealth RNAi™ : siRNA 12935-027- VHS40497).

Le « mismatch » a été utilisé comme contrôle pour chaque expérience de neutralisation.

Nom de la séquence Séquence sens

Mismatch (Contrôle) 5’-UCGGCUCUUACGCAUUCAA-3’

p14ARF 5’-GAACAUGGUGCGCAGGUUCTT-3’ PTP-RT 5’-GGAGGAGCCACUUCAGAAGUCACGG-3’ EGFR EGFR-L858R EGFR-Del19 TIP60 5’-CUCUGGAGGAAAAGAAAAGAAAGU-3’ 5’-CACAGAUUUUGGGCGGGCCAA-3’ 5’-GCUAUCAAAACAUCUCCGAAA-3’ 5’-AUAGUACAGUGUCUUAUGGUCAAGG-3’

Les cellules sont transfectées à 50-70% de confluence,24 heures après l’ensemencement, par l’OlifectamineTM _{(Invitrogen). Pour une pétri, 30µl de siARN à 20 µM est mélangé à 530 µl de}

RPMI (sans SVF) dans un tube de polypropylène. Dans un autre tube, 12 µl d’OligofectamineTM

sont mélangés à 33 µl de RPMI (sans SVF). Le mélange (45 µl) est incubé pendant 10 minutes à température ambiante. Suite à cette incubation, les siARN sont mis en présence de l’OligofectamineTM _{pendant 20 minutes à température ambiante. Pendant cette incubation, les}

85| P a g e RPMI (sans SVF) sont ajoutés à la pétri. A la fin des 20 minutes d’incubation permettant la formation du complexe des siARN avec l’OligofectamineTM_{, le mélange (600µl) est réparti}

uniformément dans la pétri, puis incubé 4h à 37°C. Au terme de cette incubation, 1.5 ml de milieu contenant 30% de SFV sont ajoutés à la pétri pendant 72h à 37°C. Aux termes de cette incubation, les cellules sont trypsinisées, dénombrées, et les culots cellulaires sont divisés pour des extractions protéiques, d’ARN et/ou un marquage de la caspase 3 active.

A.1.4. Traitement à la Cucurbitacine I (JSI-124)

La cucurbitacine I (JSI-124) est un inhibiteur très efficace de la phosphorylation de la tyrosine 705 de STAT3 (10µM-4h) (Blaskovich M.A. et al., 2003). La cucurbitacine I est également décrite pour inhiber la phosphorylation de Jak-2, mais ne bloque pas son activité tyrosine kinase.

La cucurbitacine I stock est sous forme de poudre conservée à -20°C (Santa Cruz Biotechnology). Après reconstitution dans du DMSO à une concentration finale à 2 mM, les aliquots sont stockés à -20°C pendant 3 mois maximum.

Les cellules sont traitées soit par le DMSO (contrôle), soit par la cucurbitacine I à 2µM pendant 24h. Aux termes de ce traitement, les cellules sont trypsinisées et les culots cellulaires sont divisés pour des extractions protéiques et d’ARN.