Culture dans le "Bioflow C30"

La fixation d’azote en anaérobie et à lumière a été largement étudiée et le système de régulation de la nitrogénase est très bien développé dans ce mode de culture. Or il n’avait jamais été démontré que c’est ce même système de régulation qui s’applique à R. capsulatus quand elle fixe l’azote en microaérobie à la noirceur. Donc le but de nos expériences dans cette partie était d’essayer de développer ce deuxième mode de croissance de R. capsulatus afin de permettre des études futures du système de régulation de la nitrogénase à la noirceur. On doit tout d’abord déterminer les conditions opératoires dans les quelles R. capsulatus fixe l’azote en microaérobie à la noirceur.

Figure 22 : Mise en culture de Rhodobacter capsulatus en microaérobie à la noirceur dans

Le principal paramètre à déterminer est la concentration d’oxygène sachant qu’on doit identifier la concentration maximale qui permet à R. capsulatus de croître sans pour autant inhiber sa nitrogénase. Pour réaliser cette étude, la culture a été faite dans un petit biofermenteur (Figure 22). Ce système nous garantit une régulation automatisée de la température et de l’agitation. Il présente aussi l’avantage de se connecter à des entrées et des sorties de gaz (Figure 22). On a choisit une concentration d’oxygène de départ et puis selon l’état de la culture on a décidé si on avait besoin de l’augmenter ou de la diminuer. On a alors commencé avec une culture à 20 mM d’ammonium et 1 % d’O2 pour avoir un

seul facteur varié par rapport à une culture aérobie dans "l’erlenmeyer" (Figure 23). La concentration d’oxygène dans le gaz barbotant (nitrogène) était assurée par un mélangeur de gaz composé de deux contrôleurs du flux des masses digitaux.

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 -50 0 50 100 150 200 D O à 6 00 n m Temps (h) [O2] = 2% [O2] = 1% [O2] = 4%

Figure 23 : Suivi de la croissance de la souche sauvage de R. capsulatus à 20 mM

d’ammonium dans le "Bioflow C30" (débit du gaz = 10 ml/min)

On a remarqué que plus la concentration d’oxygène augmente, plus la croissance cellulaire croit chez la souche sauvage de R. capsulatus (Figure 23). La pente de la courbe entre 2 et 4% d’O2 est presque droite. Ce qui nous montre que notre bactérie a encore besoin

va lui donner de l’O2, plus la croissance cellulaire sera importante. C’est la raison pour

laquelle on a pensé à faire une deuxième culture qui démarrera avec 4% d’O2 mais cette

fois-ci à faible concentration d’ammonium [NH4+]= 4 mM (Figure 24).

D’après la figure 24, on a remarqué que R. capsulatus est capable de fixer l’azote à la noirceur en présence de 10% d’O2. La courbe représentative de la variation de la croissance

cellulaire au cours du temps en présence de 10% d’O2 et à la noirceur montre les

principales phases de toute courbe de croissance: une phase exponentielle jusqu’à 200 h de culture, une petite phase stationnaire et en fin une phase de déclin. Et afin de vérifier que la bactérie est dans des conditions fixatrices d’azote, il faut tester l’activité de la nitrogénase et par la même occasion visualiser l’état de modification de la protéine Fe par Western blot. Cette étude doit se faire quand la culture cellulaire est à son maximum. Alors on a commencé à prélever des échantillons de la culture cellulaire au moment où la DO a dépassé le 1 (à t = 100 h dans la figure 24). Le suivi de l’activité cellulaire et la protéine Fe a pris fin quand on a senti que la croissance cellulaire s’approchait de la phase stationnaire (à t = 200 h dans la figure 24). 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 -100 0 100 200 300 400 500 D O à 6 00 n m Temps (h) [O2] = 4% [O2] = 6% [O2] = 10%

Figure 24: Suivi de la culture de la souche sauvage de R. capsulatus à 4 mM d’ammonium

D’après le tableau VI, on a remarqué que la variation de l’activité de la nitrogénase est proportionnelle à la variation de la croissance cellulaire jusqu’au J10. Ce résultat confirme

que le maximum de densité cellulaire correspondrait forcément à un maximum d’activité fixatrice d’azote. De plus, l’activité élevée de la nitrogénase prouve que la petite quantité d’ammonium ajouté au départ a été déjà épuisée parce que l’ammonium réprime la synthèse de la nitrogénase, ce qui nous confirme que la bactérie est entrain de croitre dans des conditions fixatrices d’azote. Étant donné que les valeurs présentées dans le tableau VI représentent la quantité d’éthylène produit par unité de densité optique, on a remarqué que la synthèse enzymatique dans chaque cellule bactérienne augmente de plus en plus. Cependant on note que l’activité de la nitrogénase par unité de densité optique au J6 est faible par rapport à celles notés au J7 et au J8. Cette différence est due à une surproduction de la nitrogénase (J7 et J8) sans pour autant qu’elle soit nécessaire à une croissance cellulaire. La diminution brusque de l’activité de la nitrogénase survenue au J10 peut être

expliquée par le fait qu’à ce moment on s’approchait de la phase de déclin de la croissance.

Tableau VI : Activité de la nitrogénase quand la croissance cellulaire est maximale en

microaérobie (10% d’O2) et à la noirceur

J6 J7 J8 J10

Activité de la nitrogénase (nmol/min/DO)

17,78 44,69 53,99 8,053

La visualisation par Western Blot des prélèvements effectués au même moment que les tests d’activité de la nitrogénase, montre qu’à ce moment la protéine Fe est sous une forme native (non modifiée par attachement d’un groupement ADP-ribose). Ce qui est en concordance avec l’activité élevée de la nitrogénase notée pendant ce temps là (Figure 24).

Protéine Fe

ADP-ribosylée Protéine Fe J10 J8 J7 J6

Figure 25 : Visualisation par Western Blot de d’état de modification de la protéine Fe

Puisque dans l’étude précédente la bactérie a épuisé tout l’ammonium qui se trouvait dans le milieu de culture, on a refait une autre culture microaérobie (10% d’O2) à la noirceur

sans ammonium (avec du RCV seul) mais en gardant la même concentration d’O2 (Figure

26). 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 -50 0 50 100 150 200 250 D O à 6 00 n m Temps (h)

Figure 26 : Culture en microaérobie (10% O2) à la noirceur de la souche sauvage de

R.capsulatus sans ammonium

La variation de la densité cellulaire au cours du temps montre une bonne croissance cellulaire mais malheureusement on n’a pu aller jusqu’à la phase stationnaire à cause d’un problème technique qui nous a obligé à arrêter la culture après 240 h de culture. Mais la conclusion qu’on peut tirer de cette courbe est que les conditions de culture (noirceur avec

10% d’O2 et avec un milieu sans ammonium) sont favorables à une bonne fixation d’azote

en microaérobie à la noirceur.

La visualisation de l’état de la protéine Fe par Western Blot des échantillons pour lesquels on a noté une bonne activité de la nitrogénase confirme ce qu’on a déjà retrouvé dans l’expérience précédente (figure 27).

Protéine Fe

ADP-ribosylée Protéine Fe J9 J8 J7 J3