Chapitre 4 : Résultats et discussions
4.1.2 Cube avec chanfrein (cube modifié)
4.1.2.2 Cubes avec modification de la position du chanfrein
A análise de linearidade foi obtida pelos resultados de cinco curvas analíticas na faixa de concentração de 2,5 a 40 g/mL. O coeficiente de correlação obtido (r = 0,99991) a partir dos valores médios de absorbância acrescidos dos desvios padrão versus a concentração de fármaco demonstram a boa linearidade do método. A análise de variância (TABELA 16) dos resultados demonstra ainda que a regressão linear foi estatisticamente significativa e sem falta de ajustes (p < 0,05).
TABELA 16. Análise de variância (ANOVA) para a linearidade do método
Parâmetro Graus de liberdade Soma quadrática Média quadrática F P Regressão 1 1,148 1,148 78213,646 < 0,001 Resíduos 7 0,000103 0,0000147 Total 8 1,148 0,143
5.3.4. Precisão
A precisão representa a variação dos resultados em uma série de análises de uma amostra em condições semelhantes ou diferentes de análises (BRASIL, 2003). Neste estudo, a precisão foi investigada em triplicata para diferentes níveis de concentração (10, 15, 20, 25 e 30 g/mL). A TABELA 17 apresenta os resultados obtidos para os testes de precisão intra- corrida (repetibilidade) e intercorridas (precisão intermediária).
Os resultados obtidos no estudo de precisão intra e intercorridas demonstraram a precisão do método. Em ambos os ensaios foram observados valores de CV% inferiores a 5% (ICH, 1996; BRASIL, 2003). Os resultados obtidos para cada concentração investigada nos dois ensaios foram ainda submetidos ao teste t de Student para avaliar uma possível diferença estatística. Como demonstrado na TABELA 17, não houve diferença estatística (p > 0,05) entre os valores determinados no ensaio intra-corrida, daqueles determinados em diferentes dias e com diferentes analistas. Estes resultados demonstram a precisão do método.
TABELA 17. Resultados obtidos para os ensaios de precisão intra-corrida e precisão intermediária (n=3)
[ ] µg/mL
Precisão intra-corrida Precisão inter-corridas ANOVA (P) Média ± DP (Concentração) CV (%) Média ± DP (Concentração) CV (%) 10 10,01 ± 0,19 1,85 9,78 ± 0,34 3,44 0,352 15 14,69 ± 0,11 0,77 14,50 ± 0,59 4,05 0,618 20 19,57 ± 0,34 1,72 19,45 ± 0,57 2,96 0,777 25 24,77 ± 0,35 1,43 23,77 ± 0,67 2,84 0,085 30 29,84 ± 0,59 1,97 28,52 ± 0,91 3,18 0,102
O estudo de precisão inter-laboratorial foi realizado com o objetivo de avaliar mudanças como condições de trabalho, equipamentos e implementos. Para isto, foram avaliadas três determinações para cada concentração (10, 15, 20, 25 e 30 g/mL) em dois laboratórios diferentes utilizando equipamentos distintos como mostrado na TABELA 18.
TABELA 18. Resultados obtidos para o ensaio de reprodutibilidade (n=3) [ ] µg/mL
Laboratório A Laboratório B ANOVA
(P) Média ± DP (Concentração) CV (%) Média ± DP (Concentração) CV (%) 10 10,36 ± 0,39 3,79 9,88 ± 0,33 3,34 0,258 15 15,75 ± 0,58 3,67 15,57 ± 0,78 4,99 0,811 20 20,64 ± 0,77 3,73 20,46 ± 0,92 4,48 0,847 25 25,58 ± 0,89 3,46 25,50 ± 0,81 3,19 0,928 30 30,64 ± 1,40 4,56 29,87 ± 0,84 2,82 0,436
Os resultados experimentais (TABELA 18) confirmam os estudos de precisão intra e inter-corridas. Os valores de CV% observados foram menores que 5%, indicando que as mudanças inseridas no teste não foram capazes de alterar a precisão do método. Além disso, o estudo foi conduzido para cinco níveis de concentração e em triplicata e, quando comparados os dados obtidos das determinações realizadas em diferentes laboratórios através do teste t de Student, não foi observada diferença estatística (p > 0,05).
5.3.5. Exatidão
A exatidão do método pode ser expressa como a porcentagem da recuperação de uma quantidade conhecida de fármaco adicionado à amostra. Esta amostra pode ser a forma farmacêutica ou somente o placebo (mistura dos excipientes). O ensaio de exatidão descreve ainda o grau de veracidade dos resultados obtidos da análise quantitativa (ICH, 1996; BRASIL, 2003). Neste estudo, foram investigados cinco níveis de concentração (10, 15, 20, 25 e 30 g/mL) em triplicata, utilizando o ensaio do placebo contaminado. Os resultados do ensaio estão apresentados na TABELA 19.
TABELA 19. Resultados obtidos no ensaio de exatidão (n=3) Concentração teórica (µg/mL) Concentração experimental ± DP (µg/mL) Recuperação ± DP (%) CV (%) 10 10,37 + 0,17 103,76 + 1,73 1,66 15 15,45 + 0,39 102,99 + 2,57 2,49 20 20,43 + 0,56 102,15 + 2,81 2,75 25 25,69 + 0,46 102,76 + 1,83 1,78 30 30,74 + 1,32 102,46 + 4,41 4,30
O limite estabelecido do nível de recuperação aceitável para produtos farmacêuticos está entre 80-120% (BRASIL, 2003). O ensaio de exatidão realizado para as diferentes
concentrações investigadas demonstrou a exatidão do método para a análise quantitativa do BNZ a partir do sistema emulsionado estudado. O nível de recuperação variou entre 102,15 a 103,76%, indicando um efeito levemente positivo da matriz no nível de recuperação do fármaco. Os dados experimentais do ensaio de recuperação para os cinco níveis de concentração investigados (10-30 g/mL) foram submetidos à análise de variância (ANOVA ―one way‖) e não foi observada diferença estatística significativa entre os valores [F(4,10) = 0,133; p = 0,967]. Estes resultados demonstram que o método pode ser aplicado com segurança.
5.3.6. Robustez
A robustez é um ensaio que permite avaliar a susceptibilidade do método a variações importantes nas condições analíticas como pH, força iônica, temperatura, solventes, entre outras condições (ICH, 1996; BRASIL, 2003). Neste estudo, a preparação das amostras envolve dissolução em metanol e posterior diluição com álcool etílico para análise em espectrofotômetro. Como parâmetro de robustez foi avaliado a partir da variação na razão de metanol/ álcool etílico utilizada para a dissolução inicial da amostra. Foram investigadas duas variações em relação ao solvente usado (100%) na metodologia: 50 e 75%. Os resultados obtidos no ensaio estão apresentados na TABELA 20.
TABELA 20. Resultados obtidos no ensaio de robustez utilizando diferentes proporções de metanol na dissolução da amostra (n=3)
Concentração teórica (µg/mL) Concentração experimental ± DP (µg/mL) CV (%) ANOVA (P) (50 %) (75 %) (100 %) 10 10,32 ± 0,70 10,48 ± 0,50 10,10 ± 0,03 4,57 0,673 15 15,40 ± 0,71 14,98 ± 0,41 14,87 ± 0,31 3,49 0,465 20 20,49 ± 1,12 19,99 ± 1,00 19,97 ± 0,72 4,59 0,784 25 25,39 ± 1,22 24,77 ± 0,96 25,09 ± 0,66 3,68 0,766 30 32,74 ± 0,05* 30,71 ± 0,93 29,75 ± 0,52 1,44 0,004 Estatisticamente diferente versus 100% (p < 0,05)
Através da análise da robustez é possível observar que mesmo com a ampla faixa de variação na composição do solvente utilizado para a dissolução da amostra, não foi verificada alteração relevante nos parâmetros de recuperação e precisão do método. Para todos os níveis de concentração investigados, o coeficiente de variação (CV%) obtido foi inferior a 5%.
Todas as análises foram realizadas em triplicata preservando as mesmas condições. Além disso, após submeter os dados experimentais obtidos para cada concentração, a análise de variância (ANOVA ―one way‖) não foi observada diferença estatística significativa para as concentrações de 10 g/mL [F(2,6) = 0,423; p = 0,673]; 15 g/mL [F(2,6) = 0,872; p = 0,465]; 20 g/mL [F(2,6) = 0,253; p = 0,784] e para 25 g/mL [F(2,6) = 0,279; p = 0,766]. Quando a variação da razão de metanol foi de 50%, foi observada diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (100%) [F(2,6) = 16,526; p = 0,04]. Esta mesma diferença não ocorreu para a concentração de 75%, a qual está bem mais próxima da condição real de análise planejada para o método de análise quantitativa para o BNZ no sistema emulsionado estudado. Estes resultados demonstram a robustez do método mesmo com variação tão ampla na proporção dos solventes utilizados.
6. CONCLUSÃO
Com os resultados obtidos nesse trabalho foram possíveis as seguintes conclusões:
Desenvolvimento dos sistemas emulsionados a partir do óleo de soja:
A otimização das condições de preparo permitiu obter emulsões estáveis em EHL 9 utilizando os tensoativos Tween®80 e Span®80 pelo método de emulsificação por inversão de fases na temperatura de 70 °C.
O diagrama de fases pseudoternário permitiu identificar as regiões de formação de diferentes sistemas e a escolha de um ponto de formação de emulsão para o estudo de estabilidade, a incorporação do BNZ bem como a investigação da reologia.
As emulsões permaneceram estáveis durante 30 dias na temperatura de 25 °C e quando submetidos ao estresse térmico durante o período estudado (30 dias). No entanto, na temperatura de 45 °C e 4°C mostrau falta de estabilidade físico-química ao final do teste.
As emulsões estudadas apresentaram comportamento pseudoplástico. A viscoelasticidade das emulsões mostrou ser dependente da freqüência angular com ausência do módulo de armazenamento e s comportamento viscoso de todas amostras. A adição de cotensoativos diminuiu a estabilidade das emulsões e as demais alterações na composição não revelaram mudanças na estabilidade.
A incorporação do BNZ à emulsão foi três vezes maior quando comparado com sua fração solúvel em água. Os cotensoativos utilizados mostraram efeito positivo no aumento da incorporação do fármaco. O aumento da proporção de óleo de soja no sistema diminuiu a incorporação de BNZ e, entre as razões de tensoativos utilizadas não houve diferenças estatísticas.
Desenvolvimento dos sistemas emulsionados a partir de triglicerídeo de cadeia
média:
Amostras em EHL 16 mostraram maior estabilidade na formaçãode sistemas translúcidos quando utilizados os tensoativos fosfatidilcolina de soja e oleato de sódio.
A construção do diagrama de fases pseudoternário permitiu a formação de emulsões, nanoemulsões assim como uma grande área de formação de sistemas viscosos.
As amostras apresentaram comportamento Newtoniano, com exceção daquelas que apresentaram estruturas cristalinas (comportamento pseudoplástico). O comportamento viscoelástico das amostras pseudoplásticas foi confirmado com o aparecimento do módulo de armazenagem (G’). A determinação do tamanho da gotícula mostra que as amostras apresentaram tamanho diminuto e em conjunto com a microscopia de luz polarizada é possível classificar as NE e CL.
O aumento na razão de tensoativos promove uma organização do sistema com o aparecimento de estruturas de fase lamelar.
A incorporação de BNZ aos sistemas nanoemulsionados foi sete vezes superior quando comparado à fração solúvel do fármaco em água e o sistema anisotrópico do tipo fase lamelar permitiu um aumento de 33,5 vezes na incorporação. Assim, a incorporação do BNZ nos sistemas contendo Miglyol®810 foi superior aos sistemas contendo óleo de soja como fase interna, os quais apresentaram capacidade limitada de incorporação.
Validação da metodologia analítica:
A validação do método analítico para o BNZ, a partir do sistema emulsionado por espectrofotometria de UV, demonstrou especificidade e linearidade dentro da faixa de concentração empregada. Os parâmetros analíticos investigados indicam um método simples, rápido, preciso, exato e que pode ser aplicado com segurança e confiabilidade na determinação do teor de fármaco incorporado na emulsão lipídica.
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