2. MATERIEL ET METHODE
2.1. Critères d’inclusion et données étudiées
• Ant icorpo ant i-IgG de camundongo produzido em cabra, conj ugado com Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, EUA).
Material e Métodos
3.5.3. Marcadores Fluorescentes• Faloidina - t oxina produzida pelo cogumelo Amanit a f al oide, que liga- se especif icament e aos f ilament os de act ina (F-act ina). Faloidina conj ugada com Alexa Flúor 488 (Molecular Probes Eugene, OR, EUA). • DAPI (4’ ,6-diamidino-2-f enilindole, dihidrocloride) - para visualização
dos núcleos celulares (Molecular Probes Eugene, OR, EUA);
3.6. Corantes
3. 6. 1. Coomassie Brilliant Blue G
Foi ut ilizado para a quant if icação de prot eínas em solução (Spect or, 1978). O reagent e f oi preparado em nosso laborat ório, Coomassie Brilliant Blue G 117µM (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO, EUA), et anol 4,8% e ácido f osf órico 8,5% (Merck, Darmst adt , Alemanha) diluídos em água dest ilada.
3. 6. 2. Azul de Toluidina
Os glicosaminoglicanos corados com azul de t oluidina apresent am met acromasia, que result a na mudança da cor azul do corant e, para roxo (Jaques et al ., 1968). Dest a f orma, para a coloração dos GAGs após a elet rof orese em gel de agarose, f oi ut ilizada uma solução com azul de t oluidina 0,1% (Fisher Scient if ic Co., Fair Lawn, NY, EUA), et anol 50% e ácido acét ico 1% diluídos em água dest ilada, o excesso de corant e f oi removido pela mesma solução, sem o corant e.
3. 7. Glicosaminoglicanos padrões
• Heparam sulf at o purif icado de pulmão bovino como descrit o por Diet rich e Nader (1974);
• Condroit im 4-sulf at o e condroit im 6-sulf at o, ext raídos respect ivament e de cart ilagem de baleia e de t ubarão (Seikagaku, Kogyo Co, Tóquio, Japão);
• Dermat am sulf at o, ext raído de mucosa int est inal bovina (Opocrin Laborat ories, Modena, It ália).
3. 8. Outros materiais
• Agarose (BioRad Laborat ories, Inc.Richmond, CA, EUA);
• Albumina sérica bovina (BSA) Fração V (Sigma Chemical Co.St . Louis, MO, EUA);
• Bromet o de cet ilt rimet ilamônio (CETAVLON) (Merck Darmst adt , Alemanha);
• Câmara de Neubauer (Abbot t );
• EDTA - Et ilenodiamino t et racet at o (Sigma Chemical Co.St . Louis, MO, EUA);
• Et anol absolut o (Merck Darmst adt , Alemanha);
• Filt ro para 500mL com membrana de acet at o de celulose 0,22µm, Modelo 25942, da (Corning Laborat ory Sciences Co., NY, EUA);
• Filt ros para 150mL com membrana de acet at o de celulose de 0,22µm, modelo St erif il D-6S (Milipore Corp., Bedf ord, MA, EUA);
• Formaldeído 20% em ampola (Elect ron Microscopy Science Ft . Washingt on, PA, EUA);
• Garraf as de cult ura, 150cm2 da (Corning Laborat ory Sciences Co., NY, EUA);
• Glicina (Merck Darmst adt , Alemanha);
• Insulina ext raída de pâncreas bovino (100mg em pó) Sigma;
• Lâmina hist ológica Whit e glass, especial para microscopia (Knit t el Glaser Alemanha);
• Lamínulas para cult ivo de células com 12mm de diâmet ro (Glast écnica, São Paulo, SP, Brasil);
• Líquido de cint ilação: Ult ima Gold (Packard Inst rument s Company Inc.Downers Grove, IL, EUA);
Material e Métodos
• Meio de mont agem aquoso Fluoromount -G (Elect ro MicroscopySciences, Ft . Washingt on, PA, EUA);
• Membrana de diálise Spect rapor com poro de 6000 a 8000 kDa (Spect rum Medical Indust ries, Houst on, TX, EUA);
• Papéis What man nº 1 e 3MM (W & R Balst on Lt da, Inglat erra);
• Placas de cult ura, “ mult iwell” de 6, 24 e de 96 poços (Nalge Nunc Int ernat ional Corporat ion Naperville, IL, EUA);
• Placas para cult ura de poliest ireno de 35x10mm e 60x10mm (Falcon, New Jersey, EUA);
• TGF-β1 Humano Recombinant e (R&D Syst ems, Inc. Minneapolis, MN), amost ra liof ilizada de TGF-β1 (2µg) reconst it uída com 4 mM HCl est éril cont endo 1 mg/ ml de BSA para uma concent ração f inal de 2µg/ ml. Alíquot as de 200µl f oram est ocadas a –70° C;
• Transwell® placa de 6 poços, cont endo 6 insert os com membrana de policarbonat o de 24mm com poros de 0,4µm (Cost ar Corning Incorporat ed, NY, EUA);
• Saponina (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO, EUA);
• Tubos para cent ríf uga de 15 ou 50mL est éreis (Corning Laborat ory Sciences Co., NY, EUA);
• Unidade f ilt rant e para seringa com membrana de acet at o de celulose 0,22µm (Millipore Corporat ion, Bedf ord, MA, EUA);
• Uréia ult rapura (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO, EUA);
3. 9. Aparelhos
Além dos aparelhos usuais de laborat ório f oram ut ilizados:
• Agit adores: Vort ex-Genie 2 modelo G250 (Scient ific Indust ries Bohemia, NY, EUA) e Corning St irring Plat e (Corning, NY, EUA);
• Aut oclave vert ical e horizont al (Soc. FABBE Lt da, São Paulo, SP, Brasil); • Banhos de t emperat ura const ant e (FANEM Lt da., São Paulo, SP, Brasil); • Câmaras para elet roforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por
Jaques e col. (1968), manuf at urado pela (Técnica Permat ron Lt da São Paulo, SP, Brasil);
• Cent rífuga de eppendorf modelo 5415C (W Brinkman Inst rument s, Inc. est bury, NY, EUA);
• CycloneTM Sist ema de est oque de f ósf oro (Packard Inst rument Company
Meriden, CT, EUA), com sof t ware Opt iQuantTM, para análise de imagem;
• Cont ador de cint ilação TRI-CARB 2100TR (Packard Meriden, CT. EUA); • Espect rofot ômet ro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scient ific, EUA); • Espect rofot ômet ro Spect ronic 2000 (Baush & Lomb Rochest er, NY, EUA)
e Espect rof ot ômet ro U-2000 Hit ashi (Tóquio, Japão); • Est ufa (Soc. FABBE Lt da, São Paulo, SP, Brasil);
• Fluxo laminar horizont al (Vecco, Campinas, SP, Brasil);
• Font es de corrent e cont ínua e reguláveis desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa (Técnica Permat ron Lt da., São Paulo, SP, Brasil);
• Incubadora de CO2 modelo 315 acoplada a t orpedos de CO2 pelo Gas
Guard modelo 3030 (Forma Scient if ic Mariet t a, OH, EUA);
• Lâmpada de U.V. de alt a int ensidade modelo UVG-11 (Ult ra-Violet Product s Inst . San Gabriel, CA, EUA);
• Leit or de ELISA EXL800, Universal Microplat Reader (Bio-TEK Inst rument s, Inc.);
• Medidor de pH modelo 125, da (Corning Laborat ory Sciences Co., NY, EUA);
• Microagit ador magnét ico modelo PC-161 (Corning Laborat ory Sciences Company, NY, EUA);
• Microscópio AFM invert ido de campo claro e cont rast e de fase (Nikon,
•
Nippon Kogakuk, Tóquio, Japão);
Microscópio invert ido de campo claro e cont rast e de f ase, modelo TE- 100, com câmera f ot ográf ica digit al acoplada, modelo Coolpix 990, ambos (Nikon, Nippon Kogakuk Tóquio, Japão);
Material e Métodos
• Microscópio de Fluorescência Nikon Eclipse E600 (Nikon, NipponKogakuk Tóquio, Japão);
• Microscópio confocal de varredura a laser LSM-510 NLO (Zeiss Carl, Jena, Alemanha).
4. MÉTODOS
4. 1. Cultura das linhagens IEC, Caco-2, HCT-116 e fibroblastos
Células das linhagens IEC, Caco-2 e f ibroblast os f oram mant idas em meio DMEM enriquecido com 10% de SFB a 37° C sob t ensão de 5% de CO2. A linhagem IEC recebeu suplement ação de insulina bovina (4 µg/ ml). A linhagem HCT-116 f oi mant ida sob as mesmas condições descrit as acima, porém em meio RPMI. Para o subcult ivo, placas de 60x10mm (Falcon, New Jersey, EUA) de células conf luent es f oram lavadas com uma solução de EBSS para t ot al remoção do SFB. Em seguida, f oi adicionada solução de Tripsina/ EDTA em PBS – 0,2% de t ripsina, 0,02 % de EDTA. As placas f oram mant idas no f luxo laminar de 3 a 4 min. para que as células se desprendessem.
As células f oram ressuspensas cuidadosament e com uma pipet a Past eur e colocadas em novas placas cont endo o respect ivo meio enriquecido com 10% de SFB. Após 24 h, o meio de cult ura f oi t rocado, e a part ir daí as t rocas ocorreram a cada dois dias, at é obt enção da conf luência necessária para novo ensaio ou para post erior subcult ivo.
4. 2. Meio Condicionado
As células da linhagem Caco-2 e os f ibroblast os f oram cult ivados em placas P100 (Falcon, New Jersey, EUA) em meio DMEM com soro, at é at ingirem aproximadament e 70% de conf luência. Após est e período, as células f oram lavadas várias vezes com PBS/ BSA (1mg/ ml), e cult ivadas por 48 h em meio sem soro, para produção do meio condicionado. O meio condicionado colet ado f oi armazenado a –70° C ou pref erencialment e usado f resco.
Para os experiment os de marcação met abólica dos GAGs, f ibroblast os e células Caco-2 f oram plaqueados numa concent ração de 3.105 células em placas de 35 mm e mant idos por 24h em meio DMEM com 10%SFB. Transcorrido est e t empo, algumas placas f oram lavadas várias vezes com DMEM/ BSA (1mg/ ml) e receberam o meio condicionado. Os cont roles f oram mant idos em DMEM com 10% SFB (subst it uído por soro dialisado durant e a marcação met abólica).
Para os experiment os de prolif eração celular f oram plaqueadas 3.104 células em placas de 6 poços recebendo o meio condicionado sob as mesmas condições acima cit adas. Os cont roles f oram mant idos em DMEM com 10%SFB ou sem soro. Para est e experiment o as células f oram mant idas em cult ura por 7 dias.
4. 3. Transwell®
As linhagens Caco-2 e os f ibroblast os f oram cocult ivados em sist ema Transwell para análise da int eração câncer-est roma in vit ro. Para os experiment os de prolif eração celular, f oram plaqueadas 2,5.104 células no insert o (acima) e 5.104 células na placa, que f oram mant idas por 7 dias.
Para os experiment os de marcação met abólica dos GAGs, imunocit oquímica e biologia molecular, f oram plaqueadas 2,5.105 células no insert o (acima) e 5.105 células na placa e mant idas por 4 dias.
As células, em ambos compart iment os f oram mant idas em meio DMEM com 10%SFB (para os experiment os com [35S]-Sulf at o o soro f oi previament e dialisado). A membrana do insert o Transwell® apresent a poros de 0,4µm, que permit e a t roca de f at ores de cresciment o ent re as células. Os grupos cont roles,
insert o meio DMEM Caco-2 Fibroblast os insert o meio DMEM Fibroblast os Caco-2
Material e Métodos
para t odos os experiment os f oram cult ivados sob as mesmas condições, porémsem o insert o Transwell®.
4.4. TGF-β1 exógeno
Foram plaqueadas 3.105 células (f ibroblast os e células da linhagem Caco-2) em placas de 35mm de diâmet ro, e mant idas em DMEM com 10%SFB por 3 dias. Após esse período, as cult uras celulares subconf luent es f oram incubadas por 16h com DMEM/ BSA (1mg/ ml) para ret irar f at ores de cresciment o exógenos, present es no soro. Finalment e, as células f oram lavadas com EBSS e incubadas por 24h na presença ou ausência de TGF-β1 nas concent rações (2ng/ ml; 4ng/ ml e 8ng/ ml) em meio de cult ura sem soro. Em t odos os casos, após 4h, 100µCi/ ml de [35S]-sulf at o de sódio f oram incluídos no meio de incubação.
4. 5. Marcação Metabólica de Glicosaminoglicanos Extraídos de Linhagens
4.5.1. Incorporação de [35S]-Sulfato para Análise Estrutural de
Glicosaminoglicanos
As células f oram cult ivadas em um número de 3.105, em placas de 35mm de diâmet ro (grupos cont role, com meio condicionado e com TGF-β1) e em placas de 6 poços, como descrit o no it em 3. (grupo Transwell®) por 3 dias, at é at ingirem subconf luência. Para a marcação met abólica, realizada do 3° para o 4° dia de cult ivo, as células f oram lavadas 3 vezes com EBSS e a seguir f oi adicionado meio de marcação. O meio de marcação cont inha [35S]-sulf at o numa concent ração f inal igual a 100µCi/ ml sem soro (para meio condicionado e TGF- β1) ou com SFB previament e dialisado cont ra NaCl 0,15M em membrana de diálise Spect rapor com poro de 6000 a 8000kDa (Spect rum Medical Indust ries, Houst on, TX, EUA). As células f oram mant idas por 24h a 37oC sob t ensão de 5% de CO2. Após o t empo de incubação, o meio f oi removido e armazenado a -20° C
para post erior análise. As células f oram lavadas 3 vezes com PBS, e removidas da placa com 1mL de EDTA 0,025% em PBS, após 30min. (para que as células se desprendessem, deixando a mat riz na placa). As células removidas f oram colocadas em microt ubos, onde f oi adicionado 1ml da solução de uréia 3,5M em
t ampão Tris-HCl 10mM, pH 8,0. Finalment e, as placas receberam uma solução de t ripsina em PBS (5% de t ripsina, 4% EDTA 0,025%) para remoção da mat riz; após 16h a mat riz f oi removida com o auxílio de um “ scrapper” . Uma alíquot a de 20µL da f ração celular f oi separada para a dosagem de prot eínas, ut ilizando-se o reagent e Coomassie Brilliant Blue G (Spect or, 1978).
Dessa f orma f oram obt idas as marcações met abólicas com [35S]-sulf at o da célula, meio de cult ura e mat riz ext racelular das linhagens est udadas.
4. 5. 2. Extração de GAGs marcados metabolicamente com [35S]-sulfato
Após a marcação met abólica, o ext rat o celular, o meio de cult ura e a mat riz ext racelular f oram submet idos à prot eólise com Maxat ase (4mg/ ml em Tris-HCl 50mM, pH 8.0 cont endo 1,5mM NaCl) a 60ºC por 24h. Após a prot eólise as amost ras f oram cent rif ugadas a 5.000xg por 15min. para remoção de mat erial insolúvel. Após a cent rif ugação f oram adicionados 3 volumes de et anol ao sobrenadant e e as amost ras f oram mant idas a -20ºC por 24h. Os glicosaminoglicanos precipit ados por et anol f oram colet ados por cent rif ugação a 5. 000xg por 30min. Em seguida, os GAGs f oram analisados por elet rof orese em gel de agarose em t ampão PDA.