Critères de validation des méthodes analytiques

MEIO DE MARCADORES MOLECULARES RAPD (Genetic variability analysis of a population of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera:Noctuidae) using molecular markers RAPD)

Queiroz, P.R.1, Martins, E.S.2, Monnerat, R.G.3, Lima, L.H.C.4

Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), é uma

espécie polífaga que ataca diversas culturas economicamente importantes em vários países, inclusive no Brasil, ocasionando perdas na produção que variam de 15% a 34%. Uma das estratégias de se controlar populações de S. frugiperda é identificar marcadores que indiquem populações resistentes a determinados inseticidas, ou mesmo, buscando marcadores que apontem potenciais populações transmissoras de doenças de plantas. Uma alternativa é o uso dos marcadores dominantes gerados por RAPD. Os marcadores RAPD se baseiam na amplificação do DNA gerando simplicidade e rapidez a baixos custos. Assim, grande quantidade de polimorfismo e segmentos de DNA são obtidos em curto espaço de tempo. Os objetivos desse trabalho foram o de determinar perfis eletroforéticos e analisar a variabilidade genética entre indivíduos de uma população de S. frugiperda. Utilizando-se a metodologia de extração de DNA estabelecida, foi possível obter perfis eletroforéticos de S. frugiperda por meio de reações de RAPD. Nessas reações foram usados os primers OPA-03, OPA-04, OPA-10, OPA-11 e OPA-13 que produziram diferentes perfis eletroforéticos entre os indivíduos analisados. Esses perfis foram usados para o estabelecimento das relações filogenéticas entre os indivíduos de S. frugiperda. Por essa metodologia, observou-se variabilidade entre os indivíduos analisados. A técnica de extração forneceu DNA com qualidade para analisar a variabilidade genética de uma população de S. frugiperda por RAPD. Essa estratégia poderá ser utilizada para se estudar futuras modificações de marcadores moleculares quando novos indivíduos forem introduzidos na colônia. Além disso, com a técnica de extração de DNA foi possível obter DNA a partir de indivíduos de terceiro instar, permitindo analisar os marcadores moleculares em estágios iniciais do desenvolvimento desses insetos. Uma próxima etapa poderá ser o desenvolvimento de um banco de marcadores moleculares para o monitoramento dessa espécie em campo.

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Biólogo, doutorando, Univesidade de Brasília-UnB

2

Bióloga, mestranda, Universidade de Brasília-UnB

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Bióloga, Ph.D., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

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070 - ANÁLISE DE INFECÇÕES POR Anticarsia gemmatalis MNPV : PASSAGEM SERIADA DO VIRUS EM CULTURA DE CÉLULAS DE INSETOS (Analysis of infections by Anticarsia gemmatalis MNPV : serial virus passage in insect cell culture)

Sousa, N.O.M.1,Ribeiro, Z.M.A.2, Castro, M.E.B.3

O baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), família

Baculoviridae, infecta a lagarta Anticarsia gemmatalis, uma importante praga encontrada em plantações de soja. Sistema de infecção com base em cultura de células de insetos é uma alternativa para a multiplicação de baculovirus. No entanto, limitações têm ocorrido durante a propagação desses vírus em cultura de células, pois passagens virais sucessivas podem interferir na sua infectividade resultando na produção de mutantes FP (“few polyhedra”) ou em partículas interferentes defectivas (DIPs), por exemplo. Neste estudo, foram observadas as características morfológicas de células infectadas com AgMNPV provenientes de altas e baixas passagens e analisadas as possíveis alterações no genoma do vírus, visando contribuir para estudos de cultivo de baculovirus em sistemas in vitro. As linhagens celulares UFL-AG-286, SF-21, Tn5B1- 4 e SF-9 foram infectadas com sobrenadantes (BV – baixas e altas passagens) de células SF-9 infectadas por AgMNPV, provenientes do Instituto Butantan (SP). O DNA viral foi purificado a partir dessas células e posteriormente clivado pelas enzimas de restrição PstI e HindIII para análise. Somente as linhagens celulares UFL-AG-286 e Tn5B1-4 foram utilizadas para análise, por terem apresentado infecções mais produtivas. As infecções de baixas passagens propagaram-se mais rapidamente, apresentando efeitos citopáticos típicos de infecção produtiva, do que as de altas passagens, que mostraram alterações disformes. A análise comparativa dos DNAs de AgMNPV, clivados com as mesmas enzimas de restrição, mostrou diferenças entre os perfis de DNA de altas passagens e os de baixas passagens, e este foi similar ao do DNA de AgMNPV- 2D, usado como padrão. Algumas bandas presentes tanto nos perfis de baixas passagens quanto nos de AgMNPV-2D não foram detectadas em perfis de DNA de altas passagens. Esses resultados sugerem a ocorrência de mutantes de deleção espontânea de partes do genoma viral (DIPs) que, de acordo com a literatura, replicam a expensas do vírus selvagem (“helper”), levando a diminuição de sua infectividade à medida que aumentam as passagens virais.

1

Biologia, graduanda, Universidade de Brasíolia-UnB

2

Bióloga, M.Sc., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

3

071 - A TOXINA RECOMBINANTE Cry1Ia DE Bacillus thuringiensis, EXPRESSA EM CÉLULAS DE INSETO, POSSUI ALTA ATIVIDADE CONTRA O BICUDO DO ALGODOEIRO (Anthonomus grandis Boheman, 1843) (The Bacillus thuringiensis Cry1Ia recombinant toxin, expressed in insect cells, has high activity against the bolweevil, Anthonomus grandis Boheman, 1843)

Martins,E.S.1, Aguiar, R.W. de S.2, Ribeiro, B.M.3, Monnerat, R.G.4

O algodão é uma das principais comodities comercializadas em nível mundial. Na indústria têxtil, sua fibra é reconhecida como a mais importante e de maior valor de mercado. O Brasil já foi um dos maiores produtores de fibras de algodão. O principal fator que contribuiu para o decréscimo da cotonicultura foi o estabelecimento definitivo do bicudo (Anthonomus grandis). O seu controle é feito através do uso massivo de inseticidas químicos. Em todo o mundo, pesquisadores vem tentando conseguir, através de melhoramento tradicional, cultivares resistentes ao bicudo, porém os resultados têm sido pouco satisfatórios. Uma alternativa é o uso da biotecnologia para construção de algodão transgênico, contendo gene ou genes de resistência ao bicudo. O Bacillus

thuringiensis é um candidato natural como fonte de genes de resistência a insetos.

Essa bactéria é utilizada como agente de controle biológico em vários países por produzir toxinas inseto-específicas. Essas toxinas possuem atividade entomopatogênica, dentre elas Cry3, Cry8 e Cry1 são descritas como ativas para insetos da ordem Coleoptera. O objetivo deste trabalho foi a clonagem e a expressão de um gene cry1I, de uma estirpe de B. thuringiensis tóxica para bicudo. Primeiramente, o gene foi amplificado por PCR, usando oligonucleotídeos específicos, a partir do DNA da estirpe S1451 e depois clonado. O clone foi seqüenciado e a análise de BLAST apontou 99% de homologia com seqüências do gene cry1Ia já depositadas no GenBank. O gene cry1Ia foi, então, inserido no genoma do vírus

Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e, este foi propagado em

células de Trichoplusia ni . Após purificação viral, larvas de terceiro instar de Spodoptera

frugiperda foram infectadas com o vírus recombinante, a fim de que ocorresse a

expressão do gene cry1Ia. O Extrato das lagartas, contendo a toxina, foi testado contra larvas neonatas de bicudo, apresentando alta atividade para este inseto, indicando que este é um gene bastante promissor para a construção de uma nova cultivar de algodão resistente ao bicudo.

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Biologia, mestranda, Universidade de Brasília-UnB

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Eng. Agr., Msc, doutorando, Universidade de Brasília-UnB

3

Bióloga, Ph.D., Universidade de Brasília-UnB.

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072 - ATRATIVIDADE DE VOLÁTEIS DA SOJA INDUZIDOS POR DANOS CAUSADOS