3.4.1. Nocicepção Inflamatória Crônica Induzida por Adjuvante Completo de Freund
O modelo inflamatório crônico foi executado conforme metodologia descrita por FERREIRA et al. (2001) com pequenas modificações. Os animais foram levemente anestesiados com éter antes de receberem uma injeção intraplantar do adjuvante completo de Freund (CFA, suspensão autoclavada de Mycobacterium
tuberculosis em óleo mineral) diluído a 50% ou 80%, num volume de 20 µL, na
superfície ventral da pata posterior direita. Os animais controles receberam uma injeção de 20 µL de veículo. A hipersensibilidade mecânica e térmica foram inicialmente avaliadas 24 horas após a injeção de CFA ou veículo, estendendo-se até o 15º dia após a injeção.
3.4.1.1. Avaliação da hipersensibilidade mecânica
A hipersensibilidade mecânica foi avaliada conforme previamente descrito por PALMER et al. (2008), com pequenas modificações. Os animais foram aclimatados em caixas acrílicas individuais (9x9x8 cm) em uma plataforma elevada de assoalho aramado, permitindo acesso à superfície ventral das patas, e a hipersensibilidade foi avaliada como a resposta de retirada da pata frente à estimulação com filamentos de von Frey. Tais filamentos, com forças variando entre 0,02 a 4,0 g, foram aplicados perpendicularmente na superfície plantar da pata injetada, durante 5 s, com força suficiente para causar uma ligeira curvatura no filamento. A mediana do limiar de retirada da pata foi determinada utilizando uma adaptação do método Up-Down de Dixon (CHAPLAN et al., 1994). Uma vez determinados os valores basais, os animais foram tratados com veículo (10 mL/kg, v.o.) ou DCTN (100 mg/kg, v.o.) e avaliados nos tempos de 1, 2, 3, 4 e 24 horas após o tratamento. Após a avaliação de 24h, os animais receberam o tratamento diariamente.
3.4.1.2. Avaliação da hipersensibilidade térmica ao calor
A hipersensibilidade térmica ao calor foi avaliada conforme previamente descrito por EDDY e LEIMBACH (1953) e adaptado por LUSZCZKI e CZUCZWAR (2007). Os animais foram colocados em uma placa aquecida a 50 ± 1°C e a nocicepção foi registrada como o tempo de latência para a retirada da pata injetada, utilizando um tempo de corte de 20 s para evitar dano tecidual. Uma vez determinados os valores basais, os animais foram tratados com veículo (10 mL/kg, v.o.) ou DCTN (100 mg/kg, v.o.) e avaliados uma hora após o tratamento.
3.4.1.3. Avaliação da hipersensibilidade térmica ao frio
A hipersensibilidade ao frio foi avaliada conforme o método descrito por FLATTERS e BENNET (2004), com pequenas modificações. Os animais foram aclimatados em caixas acrílicas individuais (9x9x8 cm) em uma plataforma elevada de assoalho aramado, permitindo acesso à superfície ventral das patas, e 20 µL de acetona foram gentilmente aplicados na superfície ventral da pata posterior direita. A resposta comportamental foi avaliada durante 30 s e registrada em escores: 0 – nenhuma resposta; 1 – rápida retirada ou movimento brusco da pata; 2 – retirada prolongada ou agitação repetida da pata; 3 – agitação repetida seguida de lambida da pata. A aplicação de acetona foi repetida três vezes, em intervalos de cinco minutos, e a soma dos escores foi utilizada para as análises estatísticas. Uma vez determinados os valores basais, os animais foram tratados com veículo (10 mL/kg, v.o.) ou DCTN (100 mg/kg, v.o.) e avaliados uma hora após o tratamento.
3.4.2. Nocicepção Induzida por Capsaicina
Com a intenção de avaliar o possível envolvimento de canais TRPV1 no efeito antinociceptivo da dicentrina, os animais foram submetidos ao teste da capsaicina,
um ativador seletivo de canais TRPV1, conforme previamente descrito por SANTOS et al. (1999). Os animais foram pré-tratados com veículo (10 mL/kg, v.o.) ou DCTN (100 mg/kg, v.o.) uma hora antes do teste, ou com o controle positivo AMG9810, um bloqueador de canais TRPV1 (30 mg/kg, i.p.) meia hora antes da injeção intraplantar de 20 µL de capsaicina (5 nmol/pata). Em outro grupo experimental, os animais receberam uma co-injeção da capsaicina (5 nmol/pata) com veículo (10 µL/pata), AMG9810 (90 nmol/pata) ou DCTN (300 nmol/pata), sempre num volume total de 20 µL. Após as injeções, os animais foram colocados em acrílicos transparentes individuais (13x13x8 cm) e o tempo que os animais permaneceram lambendo ou mordendo a pata injetada foi cronometrado durante cinco minutos, sendo utilizado como indicativo de nocicepção.
3.4.3. Nocicepção Induzida por Cinamaldeído
Com a intenção de avaliar o possível envolvimento de canais TRPA1 no efeito antinociceptivo da dicentrina, os animais foram submetidos a um teste utilizando o cinamaldeído, um ativador seletivo de canais TRPA1, conforme previamente descrito por ANDRADE et al. (2008). Os animais foram pré-tratados com veículo (10 mL/kg, v.o.) ou DCTN (100 mg/kg, v.o.) uma hora antes do teste, ou com o controle positivo cânfora, um bloqueador de canais TRPA1 (7,6 mg/kg, s.c.) meia hora antes da injeção intraplantar de 20 µL de cinamaldeído (10 nmol/pata). Em outro grupo experimental, os animais receberam uma co-injeção do cinamaldeído (10 nmol/pata) com veículo (10 µL/pata), cânfora (25 nmol/pata) ou DCTN (300 nmol/pata), sempre num volume total de 20 µL. Após as injeções, os animais foram colocados em acrílicos transparentes individuais (13x13x8 cm) e o tempo que os animais permaneceram lambendo ou mordendo a pata injetada foi cronometrado durante cinco minutos, sendo utilizado como indicativo de nocicepção.
Considerando os resultados obtidos com uma única dose de DCTN neste modelo, o passo seguinte foi avaliar a possível relação dose-resposta da dicentrina administrada por via oral (para avaliar o efeito sistêmico) ou por via intraplantar (para avaliar o efeito periférico) no tempo de reação de lambida da pata injetada e na hipersensibilidade ao frio. Para tanto, os animais foram pré-tratados com veículo (10
mL/kg, v.o.) ou doses crescentes de DCTN (10 – 100 mg/kg, v.o.) uma hora antes, ou com o controle positivo cânfora (7,6 mg/kg, s.c.) meia hora antes da injeção intraplantar de 20 µL de cinamaldeído (10 nmol/pata), enquanto outros grupos experimentais receberam uma co-injeção de cinamaldeído (10 nmol/pata) com veículo (10 µL/pata), cânfora (25 nmol/pata) ou DCTN (30 – 300 nmol/pata), sempre num volume total de 20 µL. Após as injeções, os animais foram colocados em acrílicos transparentes individuais (13x13x8 cm) e o tempo que os animais permaneceram lambendo ou mordendo a pata injetada foi cronometrado durante cinco minutos, sendo utilizado como indicativo de nocicepção. Na sequência, 10 minutos após as injeções, os animais foram colocados em uma placa fria mantida a 5 ± 1° C, e a hipersensibilidade ao frio foi avaliada como o tempo de latência para a retirada da pata injetada, utilizando um tempo de corte de 40 s para evitar dano tecidual.