Les problématiques liées au sédiment vaseux
Chapitre 2. Développements et applications de techniques d’analyse à des sédiments vaseux
2.1 Création de standards pour la quantification de gènes fonctionnels, exemple du gène nirS
La quantification de gènes fonctionnels repose sur une technique d’amplification de l’ADN (PCR pour « Polymerase Chain Reaction »). Cette technique appelée, PCR quantitative (qPCR) consiste à suivre, en temps réel, la quantité d’ADN amplifié au cours d’une réaction.
Notre méthode utilise les propriétés du fluorochrome SYBRGreenI s’intercalant spécifiquement dans les molécules d’ADN. La quantité de fluorochrome capté étant proportionnelle à la quantité d’ADN initial, la mesure de la fluorescence émise par le SYBRGreenI au cours d’une réaction de PCR (40-45 cycles d’amplification) permet indirectement d’évaluer la quantité d’ADN amplifié et donc la quantité d’ADN qui était présente initialement dans l’échantillon. Afin d’évaluer cette quantité en terme de copies des gènes, une gamme de standard est nécessaire. Cette gamme est à réaliser avec des standards spécifiques à chaque gène qui sont des solutions contenant une quantité connue du fragment du gène recherché à des dilutions différentes. Ces fragments de gène, ou séquences nucléotidiques, doivent être extraits de l’environnement ou obtenues à partir de cultures pures de procaryotes possédant le gène étudié. Dans le cas de préparation via des échantillons environnementaux, l’ADN est extrait, puis le gène cible est amplifié et cloné. Les clones sont ensuite purifiés pour ne conserver que les fragments du gène ciblé. Chaque fragment et ensuite testé en qPCR avec des échantillons environnementaux. Cette section décrit en détail la procédure de préparation de ces standards avec pour exemple, la création d’une banque de standard du gène nirS, proxy de la dénitrification, le protocole est également disponible en
« fiches pratiques » en Annexe 20.
Figure 23. Procédure de mise au point de standards en vue de quantifier un gène fonctionnel dans un échantillon environnemental par PCR quantitative
Des échantillons de sédiment ont été prélevés sur la vasière de Brouage en Avril 2012 puis extraits avec le kit Power SoilTM Total RNA Isolation Kit, DNA Accessory kit (MOBIO, Carlsbad, CA, Etats-Unis). Etant donné la variabilité des communautés procaryotiques en fonction des profondeurs, les tests ont été menés avec deux types d’échantillons :
- Profondeur 1-2 cm (P3), prélevé le 20 Avril 2012 - Pool des 5 profondeurs, prélevé le 20 Avril 2012
Les échantillons ont été amplifiés par PCR selon un protocole adapté de Throbäck et al.
(2004). Le mix réactionnel (50 µL) était composé de réactifs Promega (Madison, WI, Etats-Unis) de la façon suivante : 33,7 µl H2O, Buffer 10x (5 µL), 10 mM de chaque dNTP’s (1 µL), MgCl2 25 mM (2 µL), BSA 10 mg mL-1 (2 µL), 5U/µL GoTaq® HotStart Polymerase (0,3 µL) et chaque primer à 10 µM (2,5 µL). Le programme d’amplification se composait d’une étape de dénaturation initiale de l’ADN de 15 minutes à 95°C, suivi de 35 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 secondes, une hybridation de 1 minute à 57°C, une élongation de 1 minute à 72 °C puis une élongation terminale de 9 minutes à 72°C. Les résultats ont été visualisés sur gel d’agarose 1% en déposant 5µl de produit PCR.
Les produits PCR des échantillons dilués au dixième ont été purifiés via le kit NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne) puis, l’ADN a été quantifié par mesure d’absorbance à 260 et 280 nm à l’aide du Nanodrop (ND-800, Thermo Scientific, Waltham, MA, Etats-Unis) (concentration ADN [µg mL-1] =(A260)*50). La pureté de l’ADN est donnée par le rapport (A260)/(A280) qui est considérée satisfaisant si proche de 1,80.
Le clonage a été réalisé à l’aide du kit pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, Etats-Unis), suivant les recommandations du fournisseur (les étapes sont détaillées en Annexe 20).
Un clonage consiste à liguer d’abord chaque fragment du gène amplifié (insert) à un vecteur, puis ce vecteur, via un plasmide, est intégré dans des cellules bactériennes thermocompétentes
lacZ qui ne sera alors plus fonctionnel. Les colonies d'E. coli (résistantes à l'ampicilline) qui vont se développer seront alors de couleur blanche. Au contraire, si les vecteurs n'ont pas introduit les inserts, le gène lacZ sera fonctionnel et les colonies qui se développeront seront bleues. (Figure 23). Cette réaction permet ainsi un contrôle visuel afin de ne prélever que les colonies contenant des cellules portant le fragment ciblé. Les clones « blancs » récupérés ont à nouveau été mis en culture (1 nuit à 37°C). Dix colonies blanches ont été sélectionnées et mises en culture en milieu liquide (LB + ampicilline 50 µg mL-1). La purification des clones a été réalisée à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid ® (Macheney-Nagel) pour n'obtenir que les plasmides ayant incorporé l'ADN (vecteur) que l'on souhaite étudier. L’ADN extrait a été ensuite dosé au Nanodrop.
Une qPCR a enfin été réalisée avec les clones obtenus et quelques échantillons environnementaux. Chaque mix de réaction (20 µL) a été préparée comme suit : 1x qPCR master Mix SybrGreen/ROX (Maxima, SYBRGreen/ROX, Fermentas) (10 µL), 0,3 µM de chaque primer (1 µL à 10µM), 1 µl d’échantillon et 7 µl d’eau ultra-pure (i.e. RNase et DNase-free). Le cycle d’aplification (Figure 24) a été réalisé dans un thermocycleur qPCR MxPro 3000P (Agilent Technologies, Santa-Clara, CA, Etats-Unis) équipé du logiciel MxPro (Version 4.10).
Le choix des standards se fait par une vérification de leur température de fusion (« melting temperature » ou Tm). Lorsque cette température est supérieure à 80°C, cela atteste de la présence d’amplicons spécifiques (fragments amplifiés par le couple d’amorces choisi) et donc de l’amplification du fragment ciblé. De plus, afin de quantifier justement le nombre de copies des gènes, il est indispensable que cette valeur de Tm soit la même entre le standard et les échantillons.
Figure 24. Profil thermique permettant la réaction d'amplification du gène nirS par PCR quantitative (selon Throbäck et al. (2004))
L’analyse des courbes de dissociation de la qPCR montre la répartition des amplicons pour chaque standard testé et pour les échantillons environnementaux (Figure 25). Dans ce cas, le standard le plus adapté est le C11-A36, il sera donc séquencé. Il possède une Tm de 89 °C (donc supérieure à 80°C), cette Tm est égale à celle des échantillons environnementaux (Figure 25). Les échantillons présentant un très léger pic à une Tm de 86°C, il est possible que deux versions du gène puissent s’exprimer dans la communauté. Le standard C10-A15 semblait correspondre à cette deuxième version et a donc également été séquencé.
Figure 25. Exemple d'une courbe de dissociation lors de la création de standard pour la quantification du gène nirS. Ici, 10 standards potentiels ont été amplifiés ainsi que des échantillons environnementaux.
La construction d’un arbre phylogénétique (Figure 26) contenant les séquences des standards et des séquences connues du gène nirS confirme l’affiliation des standards C11-A36 et C10-A15 avec des séquences du gène nirS retrouvées dans les bases de données disponibles (NCBI, Bethesda, MD, Etats-Unis). Les séquences proches des standards sont issues de milieux côtiers et/ou anthropisés notamment retrouvés dans la baie de Chesapeake aux Etats-Unis (Hong et al., 2014).
Figure 26. Arbre phylogénétique des séquences du gène nirS des clones C10-A15 et C11-A36 construit grâce à la méthode d'UPGMA (bootstrap=100) basé sur l'alignement des séquences de nucléotides (environ 400 pb) alignées avec le logiciel Muscle (itérations =10).
Une fois le standard validé, une gamme de dilution a été préparée (de 109 à 101 copies de nirS/µl). Les standards correspondent à des solutions aqueuses contenant les fragments du gène ainsi que le vecteur utilisé lors du clonage. Afin de déterminer la quantité de copies présentes dans la solution, un calcul tenant compte du poids moléculaire des bases nucléotidiques et du nombre de bases contenues dans le fragment et le vecteur a été effectué (Annexe 20). La gamme de concentration du standard est ensuite utilisée en duplicat lors de chaque qPCR afin d’évaluer la quantité absolue de copies de gènes présente dans les