Le CpG Flu-DBCO

Nous avons tout d’abord marqué les cellules Jurkat avec le CpG Flu-DBCO et avec le non-CpG Flu-DBCO pendant 1 h à 4°C. Nous avons ensuite vérifié en cytométrie en flux que les cellules étaient bien marquées (Figure 53 B) avant de déposer 105 cellules Jurkat sur 105 cellules RAW-Blue. Après 24 h de contact, le test Quantiblue est réalisé (Figure 53 A).

112 Jurkat

Jurkat Jurkat

Figure 53 : Activation ou non des cellules RAW-Blue mises en contact avec les cellules Jurkat ± azido sucres marquées soit avec le CpG Flu-DBCO, soit avec le non-CpG Flu-DBCO.

A. Absorbance à 642 nm pour des cellules RAW-Blue mises en contact avec 105 cellules Jurkat ayant incorporé ou non des azido sucres et marquées pendant 1 h à 4°C soit avec 5 µM de CpG Flu-DBCO, soit avec 5 µM de non-CpG Flu-DBCO. B. Histogrammes obtenus en cytométrie en flux (FACSort) des cellules Jurkat (J-Az : Jurkat sans azido sucres ; J+Az : Jurkat avec azido sucres) utilisées en (A.). C. Absorbance à 642 nm pour des cellules RAW-Blue mises en contact avec 105 ou 5 x 105 cellules Jurkat ayant incorporé ou non des azido sucres et marquées pendant 1 h à 4°C avec 5 µM de CpG Flu-DBCO. D. Histogramme obtenu en cytométrie en flux (FACSort) des cellules Jurkat utilisées en (C.). Test de Student : différence significative avec p < 0,05 *, p < 0,01 **, p < 0,001 *** ou non significative (NS).

Premièrement, nous observons que les cellules Jurkat ayant incorporé ou non des azido sucres n’activent pas les cellules RAW-Blue. Deuxièmement, nous constatons que les cellules Jurkat incubées avec le non-CpG Flu-DBCO (oligonucléotide contrôle) n’activent pas non plus les cellules RAW-Blue. Enfin, nous pouvons noter que les cellules Jurkat ayant incorporé ou non des azido sucres et marquées avec le CpG Flu-DBCO activent les cellules RAW-Blue. La différence de valeurs d’absorbances obtenues dans le test Quantiblue n’est pas significative entre les cellules RAW-Blue mises en contact avec des cellules Jurkat marquées avec le CpG Flu-DBCO ayant incorporé ou non des azido sucres. Ceci peut s’expliquer par le fait que le CpG Flu-DBCO se fixe déjà sur les cellules Jurkat non traitées (décrit dans Résultats et

discussion, paragraphe 4.1.2 Mise au point de la fixation du CpG Flu-DBCO) c’est à dire que

la fixation s’opère indépendamment du groupement DBCO, fort probablement par interaction de l’oligonucléotide avec un récepteur présent à la surface des cellules. Une telle fixation

Jurkat

A. B.

Jurkat

113 semble donc suffire à masquer la visualisation de fixation du CpG par l’intermédiaire du groupement DBCO à la surface des cellules.

Puis, nous avons fait varier le rapport cellules RAW-Blue/cellules marquées (1:1 et 1:5) pour voir si nous obtenions une activation plus importante des cellules RAW-Blue en mettant plus de cellules marquées. Comme précédemment avant de déposer les cellules Jurkat marquées avec les oligonucléotides couplés DBCO nous avons vérifié la fixation de ces derniers par cytométrie en flux (Figure 53 D). Le test Quantiblue (Figure 53 C) permet de conclure qu’un rapport 1:5 entre les cellules RAW-Blue et les cellules marquées augmente l’activation des cellules RAW-Blue produisant ainsi plus de phosphatase alcaline. Cependant, il n’y a pas plus d’activation par l’oligonucléotide CpG couplé via le groupement DBCO à la surface des cellules Jurkat (cellules Jurkat ayant incorporé des azido sucres = J+Az) que par le CpG non couplé via le groupement DBCO (cellules Jurkat n’ayant pas incorporé d’azido sucres = J-Az).

Nous avons également mis en contact les cellules EG7 et MC38-OVA marquées avec le CpG Flu-DBCO et le non-CpG Flu-DBCO avec les cellules RAW-Blue. Après avoir vérifié par cytométrie en flux, le marquage des cellules EG7 et MC38-OVA, nous les avons incubées pendant 24 h avec les cellules RAW-Blue (rapport RB/cellules marquées 1:5) et nous avons réalisé le test Quantiblue (Figure 54 A et B). Seules les cellules EG7 et MC38-OVA ayant incorporé ou non des azido sucres marquées avec le CpG Flu-DBCO activent les cellules RAW-Blue. Il n’y a pas de différence significative entre des cellules EG7 ayant incorporé des azido sucres et des cellules non traitées marquées avec le CpG Flu-DBCO. Nous obtenons le même résultat avec les cellules MC38-OVA ± azido sucres. Ces cellules marquées avec le CpG Flu-DBCO activent les cellules RAW-Blue (Figure 54 C et D).

114 EG7

MC38-OVA

Enfin, les cellules EG7 et MC38-OVA marquées avec le non-CpG Flu-DBCO n’activent pas les cellules RAW-Blue (Figure 54 A et C).

Figure 54 : Activation ou non des cellules RAW-Blue mises en contact avec les cellules EG7 ± azido sucres marquées soit avec le CpG Flu-DBCO soit avec le non-CpG Flu-DBCO et avec les cellules MC38-OVA ± azido sucres marquées soit avec le CpG Flu-DBCO, soit avec le non-CpG Flu-DBCO.

A. Absorbance à 642 nm pour des cellules RAW-Blue mises en contact avec 5 x 105 cellules EG7 ayant incorporé ou non des azido sucres marquées pendant 1 h à 4°C soit avec 5 µM de CpG Flu-DBCO, soit avec 5 µM de non-CpG Flu-DBCO. B. Histogrammes obtenus en cytométrie en flux (FACSort) des cellules EG7 (EG7- Az : EG7 sans azido sucres ; EG7+Az : EG7 avec azido sucres) utilisées en (A.). C. Absorbance à 642 nm pour

des cellules RAW-Blue mises en contact avec 105 cellules MC38-OVA ayant incorporé ou non des azido sucres et marquées pendant 1 h à 4°C soit avec 5 µM de CpG Flu-DBCO, soit avec 5 µM de non-CpG Flu-DBCO. Nous avons utilisé comme contrôle positif des cellules RAW-Blue mises directement en contact du CpG. D. Histogramme obtenu en cytométrie en flux (FACSort) des cellules MC38-OVA (MC38-OVA-Az : MC38-OVA sans azido sucres ; MC38-OVA+Az : EG7 avec azido sucres) utilisées en (C.).