A infecção por flavivírus foi identificada em duas amostras que continham a espécie Culex (culex) chidesteri, uma amostra continha 5 fêmeas e a outra 10. Todos os controles positivos testados por RT-PCR genérico (DENV1-4 e YFV) tiveram amplificação positiva. (Figura 11).
Figura 11: Gel de agarose revelando que todos os controles positivos e as duas amostras que continham as alíquotas de Culex (culex) chidesteri, R33 e R34, tiveram amplificação positiva.
O resultado do BLASTN revelou que o flavivírus identificado neste estudo é um Culex Flavivirus (CxFV), com 95% de identidade com o CxFV identificada em Uganda em 2008 (escore máximo: 206; escore total: 206; query cover: 88%; E value: 9e-50 ).
As sequências de aminoácidos e ácidos nucleícos de CxFV Assu tem uma alta identidade com outras variantes do subtipo África/Caribe/América Latina e variam de 91% a 98,6% e 91,8% e 100%, respectivamente. As sequências de ácidos nucléicos e aminoácidos do gene NS5 tem alta identidade entre as cepas dos subtipos África/Caribe/América Latina e Ásia/EUA variam de 88,3% para 95,8% e 91,8% e 100%, respectivamente (Tabela 5).
Tabela 5: : Em negrito os valores de identidade das sequências nucleotídicas e de aminoácidos de parte gene NS5de CxFV
África/Caribe/América Latina Ásia/EUA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 R33 CxFV Assu RN Brazil 2013 - 100 91.8 91.8 91.8 91.8 91.8 91.8 83.6 2 R34 CxFV Assu RN Brazil 2013 100 - 91.8 91.8 91.8 91.8 91.8 91.8 83.6 3 GQ165808 CxFV Uganda 2008 91 91 - 100 100 100 100 100 89.7 4 EU879060 CxFV Mexico 2007 91 91 98.6 - 100 100 100 100 89.7 5 JX897904 CxFV Taiwan 2010 91 91 95.8 95.8 - 100 100 100 89.7 6 HQ634596 CxFV US 2009 89.7 89.7 94.5 94.5 95.8 - 100 100 89.7 7 AB377213 CxFV Japan_2003 89.7 89.7 94.5 94.5 95.8 100 - 100 89.7 8 AB701766 CxFV Toyama 2004 88.3 88.3 93.1 93.1 95.8 98.6 98.6 - 89.7 9
GQ165809 Nakiwogo virus Uganda
Foi feita uma árvore filogenética a partir de parte do gene NS5 de CxFV Assu (143 pb), que foi gerada utilizando o método da máxima verossimilhança. A análise filogenética revelou que o CxFV Assu identificados neste estudo pertencem ao subtipo África/Caribe/América Latina. (Figura 12)
Figura 12: Árvore filogenética gerada a partir do método de máxima verossimilhança (ML) de 37 sequências de Flavivirus (36 CxFV e 1 Nakiwogo vírus – grupo externo) usando 143 nucleotídeos do gene NS5. As cepas são indicadas pelos números de acesso do Genbank ou descrição, local e ano de identificação. Os subtipos são indicados por parênteses. Os valores de bootstrap dão suporte a estatística para os ramos maiores com percentuais equivalentes.
6. DISCUSSÃO
Durante todo período de coleta do estudo, vinte e quatro meses, foram coletados um total de 1680 indivíduos da família Culicidae em três tipos de armadilhas usadas no intuito de amostrar a assembléia de culicídeos em seus quatro estágios do ciclo de vida (ovo, larva, pupa e alado) na unidade de conservação de uso sustentável, FLONA-Açu do domínio fitogeográfico Caatinga, sendo esse trabalho o único do Estado do RN nesse bioma e com essa duração.
Dentre as três armadilhas utilizadas no estudo a que foi menos eficaz foi a Ovitrampa, devido ao ambiente da Caatinga ser extremamente seco, com alta radiação solar, as armadilhas não se faziam muito eficientes, pois a evaporação chegava muitas vezes a secar a infusão. Além disso, o curto tempo em que permaneciam no ambiente (três dias) pode também ter interferido na positividade já que é preconizado pelo Ministério da Saúde a permanência média de cinco dias em campo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001). A armadilha ovitrampa é comumente utilizada no monitoramento das populações dos vetores, A. aegypti e A. albopictus,
em áreas de peridomicílio e urbano (DE RESENDE et al., 2013; WU et al., 2013), sendo também usada em coletas do gênero Haemagogus em áreas de mata (ALENCAR et al., 2013).
A armadilha Ovitrampa só foi positiva no mês de fevereiro de 2012, coletando duas espécies apenas, A. aegypti com um total de trinta indivíduos e A. albopictus com um total de dois indivíduos. A espécie A. aegypti foi coletada na armadilha no ponto 1, (mais próxima a área mais urbana do entorno da FLONA) o que corrobora com seu comportamento domiciliar. Já A albopictus, que é uma espécie com um comportamento mais peridomiciliar foi encontrada na entrada da área de mata, com mais árvores e mais distante da cidade no ponto 3 como pode ser observado na figura 7 (GONZÁLEZ; GONZÁLEZ AUDINO; MASSUH, 2014; LACON et al., 2014).
Devido à espécie A. aegypti ser a principal na veiculação dos quatros sorotipos de Dengue vírus, vírus da Febre Amarela urbana, Chikungunya e Zika vírus esse achado traz um alerta para a comunidade de Assú, por esta espécie estar
presente e ser o principal vetor desses arbovírus citados, além de A. albopictus que já se mostrou um potencial vetor de vinte e duas arboviroses assim como também já foi encontrado infectado na natureza com Dengue vírus e Encefalite Equina do Leste. Podendo ser o vetor secundário de Dengue vírus no Brasil (LUÍS; DE FIGUEIREDO, 2014; MORAIS et al., 2008).
As duas armadilhas tipo Larvitrampa amostraram um total 396 imaturos, sendo a maioria da espécie A. aegypti,seguido da unidade taxonômica Culex (culex)
sp., de A. albopictus, e por último H. spegazzinii. As três espécies coletadas costumam colonizar reservatórios pequenos, mas notavelmente A. aegypti foi a mais abundante, provavelmente por essa armadilha ser um reservatório artificial, semelhante aos vários tipos de reservatórios que essa espécie é comumente encontrada (FORATTINI, 2002). Vale salientar que foi amostrado uma grande quantidade de culicídeos que foram agrupados no táxon Culex (culex) sp., que tem uma vasta quantidade de espécies nesse subgênero, porém as chaves morfológicas atuais não permitem uma identificação segura sobre esse subgênero. Mais uma vez as espécies A. aegypti e A. albopictus estão presente em uma metodologia de coleta, retomando a preocupação acerca da transmissão dos sorotipos Dengue entre outros arbovírus. No Brasil o ministério da saúde recomenda o uso da Larvitrampa no monitoramento dos vetores A. aegypti e A. albopictus, porém outros estudos já mostraram que esta armadilha também tem eficácia em ambientes florestais (REZENDE, 2011).
A armadilha Shannon amostrou 1252 indivíduos da família Culicidae com um total de oito gêneros e dezesseis espécies, os meses que mais amostraram mosquitos foram setembro 2011, maio de 2013 e junho de 2013 enquanto que nos meses dezembro de 2011, agosto de 2012, outubro de 2012, dezembro de 2012 e janeiro de 2013 .as coletas foram negativas (Tabela 3 e Figura 9)
Dentre essas espécies a que visitou mais a armadilha foi O. scapularis com 500 indivíduos, sendo 200 indivíduos no ponto Sagui o qual fica mais próximo ao município de Assú e 300 no ponto Lagoa que fica mais próximo a Lagoa do Piató. Esses mosquitos preferem colocar seus ovos em coleções líquidas no solo, de caráter permanente ou transitório, de águas pluviais ou de inundações por parte de leitos de rios que possam a inundar cavidades no solo, ou até mesmo por pegadas
de animais ou depressões feitas por passagem de veículos inundadas, esse tipo de preferência de colonização mostra a abundância logo após a períodos chuvosos (Forattini, 2002). O que corresponde com o mês de julho de 2013 que foi amostrado 390 indivíduos dessa espécie, onde o índice pluviométrico do mês anterior, um dos maiores no decorrer do estudo foi 130.2 mm.
O. scapularis já foi encontrado infectado com Melon vírus, Ilhéus vírus,
Encefalite Equina Venezuelana do Leste vírus e Rocio vírus, esse último causou entre os anos de 1975 e 1983 mais de 1100 casos de encefalites na região sudeste, mais precisamente no estado de São Paulo. Mesmo que já se tenha passado alguns anos é importante à vigilância desse vetor devido a sua vasta distribuição. (LAPORTA et al., 2012)
Depois de O. scapularis a espécie mais abundante foi M. wilsoni com 270 indivíduos, diferente dos O. scapularis os integrantes dessa espécie precisam de plantas aquáticas para colonizarem um ambiente, pois assim que as larvas mudam do primeiro estádio larval, fixam o sifão respiratório em uma vegetação aquática, para isso o sifão e a trompa da pupa são modificados para perfurar os tecidos das plantas e retirar o oxigênio direto do parênquima aerífero. Logo à existência de indivíduos dessa espécie está diretamente relacionado a um ambiente com vegetação aquática (Forattini,1996). Quando adultos, as fêmeas tem habito hematófagico noturno, podendo aparecer no horário crepuscular são agressivas e vorazes e fortemente atraídos pela luz (Forattini, 2002). Em estudo realizado no sudeste do Brasil, no domínio Mata Atlântica, em relação a áreas degradas e as espécies que as colonizaram mostrou que mosquitos da espécie O. scapularis e os integrantes da tribo Mansoniini são bioindicadores de ambientes que sofreram ações antrópicas (DORVILLÉ, 1996). Desse modo a vasta presença desses táxons instiga estudos futuros para avaliar a taxa de degradação da FLONA – Açu, pesquisas que contemplem a fauna culicidiana de áreas degradadas e áreas conservadas de Caatinga, a fim de ver se esse padrão também se repete e assim constatar se realmente a FLONA Açu está em uma área de Caatinga degradada.
A terceira espécie mais coletada foi O. taeniorhynchus com um total de 155 indivíduos, essa espécie tem preferência por colonizar solos encharcados, assim como O. scapularis, porém com uma diferença, a água tem que ter alta salinidade,
fato esse que também são encontrados em tocas de caranguejo (Forattini, 2002). O solo do domínio Caatinga tem alta salinidade, devido às taxas de evaporação serem maiores que as da pluviosidade, o que não permite que os sais sejam lixiviados (RICHARDS, 1954).
O. taeniorhynchus já foi encontrado transmitindo o vírus da encefalite eqüina do leste, também é vetor competente para a encefalite eqüina venezuelana. E ainda, já foi encontrado naturalmente infectado pela Dirofilaria immitis, nos Estados do Rio de Janeiro e Maranhão é um vetor de importância médico veterinária (SEGURA et al., 2007; WEAVER et al., 2004; FORATTINI, 2002)
Quando comparadas as duas áreas de coletas da armadilha Shannon, Lagoa e Sagui, o ponto de coleta Sagui teve maior diversidade em relação ao ponto Lagoa, apesar de aparentemente ter mais interferência da ação antrópica. Essa classificação de mais antropizado foi decorrente da maior proximidade da cidade, do fluxo de pessoas que trabalham na FLONA e das atividades que são realizadas nas áreas de convivência, ao contrário da área da Lagoa que possuía poucas visitações e maior dificuldade de acesso. Essa contradição nos índices de diversidades obtidos pode ser devido à área Sagui ter uma Caatinga mais arbórea, enquanto a próxima Lagoa, tem uma Caatinga mais arbustiva devido ao fato de estar perto da área de transição para chegar até a lagoa do Piató, segundo o plano de manejo da FLONA-Açu (em fase de elaboração).
No intuito de visualizar os horários que tinham maiores concentrações de mosquitos visitando a armadilha nos dois pontos foram comparados os horários de captura de mosquitos em relação à abundância de mosquitos nas duas áreas, mas não demonstrou diferenças significativas, revelando que as espécies coletadas não têm preferência entre os horários de 17:00 à 20:00. Outros estudos demonstram essa relação com 12 horas de captura, a partir disso pesquisas futuras podem avaliar se existe essa relação na FLONA-Açu (GUEDES; NAVARRO-SILVA, 2013) (Figura 9).
Os fatores ambientais são grandes moduladores e exercem pressões seletivas importantes aos seres vivos, existem relações diretas entre a abundância dos mosquitos e a fatores climáticos como, umidade, pluviosidade e temperatura (YANG et al., 2008). Nesse sentido foram coletados os dados de temperatura média,
umidade relativa e pluviosidade mensal e relacionados com a abundância mensal total dos mosquitos, visto que a abundância não foi favorecida por umidade e temperatura devido a esses dados serem praticamente constantes no decorrer dos dois anos. Porém para a variável pluviosidade foi demonstrada uma relação entre essa variável e a abundância dos mosquitos, demonstrando que quantidade de culicídeos da FLONA é influenciada positivamente com a quantidade de chuva, assim como também demonstra outro estudo que foi realizado em outra unidade de conservação da Caatinga do Rio Grande do Norte, outros estudo realizados na Mata Atlântica também mostram essa mesma influência (FERNANDES, 2011, CARDOSO et al., 2011).
Com esse estudo foi registrado pela primeira vez no estado do Rio Grande do Norte a presença de dois novos registros pertencentes a subfamília Culicinae:
Mansonia pseudotitillans e Culex (culex) chidesteri. A espécie Mansonia
pseudotitillans foi encontrada em baixa frequência com apenas seis indivíduos, essa
espécie segundo Barbosa (2007) tem distribuição geográfica que vai desde a América Central: Panamá, Trindade. América do Sul: Suriname, Guiana Francesa, Venezuela, Colômbia, Peru, Argentina, Brasil. E no Brasil: Amapá, Amazonas, Pará, Paraná, Rio Grande do Sul, São Paulo, foram capturados quarenta indivíduos na armadilha Shannon da espécie Culex (culex) chidesteri, esse mosquito tem ampla distribuição pelo o continente americano desde o Uruguai até os Estados Unidos, (WRBU, 2016). Estudos mostram que fêmeas de C. chidesteri preferem se alimentar de sangue de aves, o que pode corroborar para a baixa quantidade dessa espécie na armadilha Shannon que além da luz, utiliza os odores liberados pelos coletores como atraente(STEIN et al., 2013).
C. chidesteri foi encontrado pela primeira vez infectado com o vírus Culex Flavivirus (CxFV), além de CxFV não ter sido ainda registrado para a região Nordeste do Brasil. Outros estudos já isolaram Flavivirus de C. chidesteri como o de (Pauvolid-Corrêa et al. 2015) que descreveram o isolamento de Nhumirim Virus (NHUV) de alíquotas de C. chidesteri coletados no Pantanal, centro-oeste do Brasil em 2010.
Esse Flavivirus foi isolado pela primeira vez no Brasil e na América do Sul na cidade de São José do Rio Preto em 2008 (Machado, 2012). Em todo mundo CxFV
vem sendo identificado (Hoshino et al, 2007;. Morales-Betoulle et al, 2008;. Farfan-Ale et al, 2009;. Kim et al, 2009;. Goenaga et al, 2014;.. Crockett et al, 2012; Machado et al, 2012;.. Cook et al, 2009;. Huanyu et al, 2012;. Chen et al, 2013;. Obara-Nagoya et al, 2013). CxFV parece se manter unicamente entre hospedeiros invertebrados, e segundo Bolling, 2012 em um estudo com Culex pipiens o CxFV tem somente transmissão vertical e quando infectado com Vírus do Nilo Ocidental (WNV) e CxFV nota-se uma relação de competição nos primeiros dias da infecção. Essa relação indica a interação de CxFV com WNV, o que se faz necessário mais estudos sobre as interações de CxFV.
Neste estudo, a árvore filogenética com base em parte da sequência do gene NS5 revelou que CxFV Assu pertence ao subtipo (África/Caribe/América Latina) isolados em Uganda, México e Taiwan. Os resultados são consistentes com os resultados relatados por outros autores onde as amostras isoladas em Taiwan estão intimamente relacionadas com o subtipo África/Caribe/América Latina (CHEN et al. 2013). O estudo mostrou que a distância dos nucleotídeos entre os subtipos África/Caribe/América Latina e Ásia/EUA variam de 4,2% a 11,7%. Estudos adicionais, incluindo as amostras isoladas de outras partes do mundo são essenciais para compreender melhor a história evolutiva dos CxFV.
Os dados desse estudo fornece informações sobre a fauna de culicídeos que habitam na unidade de conservação de uso sustentável, FLONA-Açu, informações que podem ser utilizadas para alertar a população que utiliza da unidade dos diversos vetores de patógenos que lá habitam, outros dados indicam um possível grau de degradação, o que deve ser consolidado com estudos posteriores que elucidem essa provável estimativa.
7. CONCLUSÕES
● Esse estudo conclui que a FLONA-Açu necessita de estudos que avaliem o grau de degradação ambiental, pois contêm espécies que ocorrem com alta freqüência em áreas urbanas, como é o caso de A. aegypti além de táxons que já foram descritos como bioindicadores de áreas degradadas.
● Os fatores ambientais umidade relativa do ar e temperatura média não influenciam as assembléias dos membros da família Culicidae, porém a pluviosidade tem uma relação direta na FLONA-Açu.
● O estudo deixa uma contribuição importante para o entendimento da culicidiofauna local, que é o registro de duas espécies, nunca antes registradas para o Estado do Rio Grande do Norte.
● A culicidiofauna da FLONA- Açu abriga uma gama de importantes vetores de patógenos e deve-se ter uma prática de vigilância entomológica constante.
● Existe arbovírus circulante na unidade de conservação, neste caso sendo o Culex Flavivirus (CxFV), o qual até o presente momento não havia registro para a região Nordeste do Brasil
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