Coupes anatomiques

L'utilisation des couteaux rigides traditionnellement utilisés en microtomie autorise des coupes de 10 à 20 pm. La qualité de ces coupes est irréprochable quand le couteau est parfaitement affûté. Cependant, la lame s'émoussant rapidement, un affûtage régulier est nécessaire. Ne disposant pas de dispositif d'affûtage au laboratoire, d'autres méthodes ont été recherchées. Afin d'obtenir des coupes aussi fines que possibles, nous nous sommes orientés vers les techniques d'inclusion. En plus de la finesse des coupes, ce procédé permet une bonne répétabilité dans l'épaisseur des coupes et une coloration plus homogène puisque l'ensemble des lames sont colorées en un seul bain.

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Après des essais avec des méthacrylates de méthyle, nous avons finalement abouti avec l'aide du Cirad Biotrop (histologie) à l'utilisation de résine HPMA (Hydroxypropyl méthacrylate) (protocole en annexe). Cette résine déjà utilisée par ce laboratoire pour l'inclusion de pépins de raisin (communication personnelle J. Escout) a permis une très bonne et rapide imprégnation du tissu ligneux. Des coupes de 1,5 à 9 |j,m sont alors réalisables sans grande difficulté à l'aide d'un microtome rotatif à lames jetables. Cependant, le procédé de dépôt de la coupe sur la lame nécessite une réhumidification de la coupe qui sèche après adhésion sur la lame. A cet instant, le fort retrait du bois dans les directions radiale et tangentielle génère de larges fissures (photo 2). Ces fissures ont été minimisées par un séchage des lames à l'air ambiant, mais leur présence est rédhibitoire pour une utilisation en vue d'un traitement par analyse d'image.

Fissures

photo 2 : fissurations au séchage d'une coupe de hêtre inclus dans une résine HPMA.

Les difficultés rencontrées lors de ces essais nous ont amenés à nous tourner à nouveau vers le microtome à glissière traditionnel (marque Reichert). Le couteau rigide étant maintenant remplacé par un porte lames jetables. Des lames "tissus durs" de la marque Feather ont donné un résultat très satisfaisant. Les lames sont changées régulièrement pour assurer un tranchant parfait à toutes les coupes.

L'épaisseur des coupes a été optimisée à 15 |xm, épaisseur la plus fine permettant une réussite quasi systématique de la coupe. Le recueil des coupes se fait sur les lames avec le doigt. Les coupes sont ensuite déposées dans un panier formé d ’une armature en aluminium, dont le fond est une toile en nylon composée de mailles très fines sur laquelle vont reposer les coupes durant toute la coloration. L'utilisation du panier permet un maniement minimum des coupes et minimise ainsi leur dégradation.

DI. 1.4. Coloration

Le premier objectif de la coloration est de donner du contraste à la matière ligneuse qui apparaît translucide sur des coupes minces observées par microscopie photonique en lumière transmise. Pour cela la safranine est couramment utilisée, toute la matière ligneuse y est colorée en rouge, sans distinction des tissus. Dans le cadre de cette étude, nous souhaitons différencier les cellules de bois normal de celles de bois de tension comportant une couche gélatineuse. Pour cela, nous devons utiliser un colorant spécifique de la lignine ou de la

cellulose. La coloration la plus fiable est probablement la réaction de Wiesner (Dop et Gautier 1928). Cette réaction colore spécifiquement la lignine. Ainsi, la fibre G apparaît incolore. Cependant, il y a deux inconvénients majeurs à cette méthode : la coloration est fugace (ce qui nécessite une prise de vue rapide dans les minutes qui suivent la coloration) et l'absence de coloration de la fibre G risque de la confondre avec les lumens lors du traitement par analyse d'image. Les doubles colorations traditionnellement utilisées telles que Safranine/Bleu Astra ou Safranine/Fast Green permettent de bien différencier à l'œil la fibre G qui apparaît respectivement en Bleu et en Vert alors que le reste des tissus est coloré en rouge. Divers tests nous ont montré qu'il est difficile de séparer les couleurs par analyse d’image. De plus l'utilisation d'images couleur nécessite une numérisation sur 24 bits, soit des images beaucoup plus "lourdes" qu'en niveaux de gris. Les recherches se sont donc orientées vers des colorants monochromatiques imprégnant plus ou moins la paroi en fonction de sa composition. C'est le cas de la coloration à l'Azur II et de celle au Bleu de Méthylène Aluné. Ces deux colorants donnent des résultats comparables : la lamelle mitoyenne est colorée en bleu turquoise, la paroi secondaire en bleu clair et la fibre gélatineuse en bleu-violacé foncé (photo 3). Le protocole expérimental (Annexe 1) étant plus simple pour l'Azur H, c'est ce colorant qui a été utilisé pour la suite de cette étude.

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photo 3 : coloration à l'Azur II d'une coupe transversale de hêtre

Les "niveaux de bleu" seront numérisés en niveau de gris sans perte d'information. III. 1.5. Acquisition des images

Les lames sont observées avec un microscope de la marque Leica mis à disposition par l'équipe histologie du Cirad Biotrop. Pour avoir l'ensemble de la coupe (environ 5000 x 1000 pm2) dans la fenêtre d'observation, nous sommes limités à un grossissement de 25X. Ce grossissement ne donnant pas le détail nécessaire pour nos observations, l'image est acquise en deux parties qui seront ensuite aboutées. Ainsi, nous avons utilisé un grossissement de 50X. Dans ces conditions, la fenêtre d'observation de 2170 x 2763 pm2 permet de

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photographier chaque coupe en deux clichés. Lahabi pour un travail similaire, montre que pour l'étude du hêtre et du chêne, un grossissement de 50X peut être suffisant bien qu'elle préconise un grossissement 100X (Lahbabi 1995). Etant donné la surface des coupes, l'utilisation d'un grossissement 100X aurait nécessité l'acquisition de 4 photos par coupe ce qui alourdissait considérablement le travail d'aboutage et la taille des images à traiter par analyse d'image.

L'acquisition se fait au moyen d'un appareil photo numérique de la marque Metrix. La résolution de l'appareil est donnée par le nombre de pixels disponibles pour couvrir la fenêtre d'observation (1316 x 1034 pixels2). L'image est numérisée en 256 niveaux de gris.

Les images ainsi numérisées sont ensuite assemblées deux à deux par superposition de la zone centrale de chevauchement.

En dernière étape, certaines images sont reprises sur un logiciel de retouche d'image (Paint Shop Pro 6) afin d ’éliminer des déchets de coupe ou des poussières (ou traces de tylles) se trouvant dans les vaisseaux (photo 4).

photo 4 : nettoyage des vaisseaux sur une coupe de châtaignier (A, avant ; B, après)