O projeto de monitoramento do acidente de vazamento da plataforma Deepwater Horizon foi conduzido pela Universidade da Flórida, sendo as coletas de ascídias realizadas pelo Prof. Tito Monteiro da Cruz Lotufo entre os dias 22 e 31 de maio de 2012 ao largo da costa oeste da Flórida (E.U.A.) (FIGURA 4).
Figura 4 – Área de amostragem da coleta de ascídias na Flórida (E.U.A.).
A amostragem foi obtida a bordo do navio R/V Bellows, do Instituto Oceanográfico da Flórida (FIGURA 5), e da lancha da Universidade da Flórida principalmente através de mergulho autônomo, entre 1 e 30 m de profundidade, mas também
com pegadores de fundo alcançando 104 m. As ascídias encontradas durante o mergulho foram coletadas com auxílio de espátulas ou quando necessário mantidas presas ao substrato, para evitar danos ao material. Em seguida, as amostras foram levadas para a embarcação de apoio e acondicionadas em recipientes plásticos. Ainda em campo, o material foi mantido em água do mar com anestésico (tricaína) durante aproximadamente uma hora, sendo em seguida fixado em formalina a 10% e finalmente transferido para etanol a 70% poucos meses depois. As amostras foram tombadas na coleção do Museu de História Natural da Flórida, sendo etiquetadas individualmente com informações relativas ao tipo de fundo, coordenadas geográficas, profundidade e data da coleta. Vale ressaltar que foi realizado o registro fotográfico e separação de tecido de cada amostra em etanol 95% para análise molecular.
Figura 5 – Navio R/V Bellows utilizado durante a coleta de ascídias na Flórida (E.U.A.).
Foram analisadas, identificadas e descritas 204 amostras de ascídias adquiridas através do plano de monitoramento do acidente da plataforma Deepwater Horizon, sendo esse material coletado a bordo do navio R/V Bellows e da lancha da Universidade da Flórida. Vale ressaltar que todo esse material foi emprestado ao Prof. Tito Monteiro da Cruz Lotufo (Instituto Oceanográfico - USP), sendo mantido no Laboratório de Invertebrados Marinhos – UFC.
2.3. Dissecção
A análise morfológica das ascídias foi realizada a partir dos procedimentos usuais, tais como foi descrita por Monniot e Monniot (1972) e Rodrigues, Rocha e Lotufo (1998). Vale ressaltar que também realizamos aqui um breve resumo dos procedimentos necessários para a análise das ascídias solitárias e coloniais.
- Ascídia solitária
Foram observadas todas as características externas da ascídia, sendo posteriormente retirada a túnica através de um corte realizado inicialmente na borda do sifão branquial em direção ao sifão atrial com o uso de tesoura de pontas grossas. Durante o processo de abertura do animal, foi necessário o afastado entre a túnica e o manto juntamente com as vísceras da ascídia com o auxílio de pinças, para que não ocorresse o rompimento dessas estruturas essenciais na identificação.
Após esse procedimento, realizamos a abertura da parede do corpo que ocorreu através do mesmo processo descrito anteriormente, no entanto, dessa vez o corte foi feito com o auxílio de tesoura de pontas finas e apenas em aproximadamente metade da faringe do animal. Em seguida, para que fosse possível analisar o material em microscópio estereoscópio, a faringe foi colocada em uma placa de Petri com parafina para melhor fixação dos alfinetes e acrescentada água para que não acontecesse o ressecamento da amostra. Além disso, os animais foram corados com Hematoxilina de Harris, permitindo assim uma melhor visualização dos caracteres internos desses organismos.
- Ascídia colonial
Foram observadas todas as características externas da colônia, sendo posteriormente realizada a retirada dos zooides da túnica. Em ascídia colonial que apresenta maior facilidade na separação visual entre os zooides foi necessária apenas a retirada do zooide da túnica com o auxílio de pinças de pontas finas (ex: gênero Clavelina). Esses zooides foram dissecados em uma placa de Petri com água, sendo realizada a observação dos caracteres internos em microscópio estereoscópio.
Em ascídias que apresentam zooides com alto grau de associação, foram realizados cortes transversais na colônia com auxílio de bisturi para observar os caracteres internos da colônia. Posteriormente, foi feita a separação de vários zooides da túnica com o auxílio de duas pinças de pontas finas, sendo colocados em uma placa de Petri com água para realizar a dissecação e observação de suas estruturas internas em microscópio estereoscópio.
Uma grande parte das ascídias coloniais pertencentes à família Didemnidae apresenta espículas calcárias distribuídas na túnica, dificultando, portanto, a visualização e retirada dos zooides. Diante disso, para que essas estruturas calcárias não impedissem a análise do material, foi necessária a imersão de cortes finos da colônia em solução aquosa saturada de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) por cerca de 24 horas. Essa substância age como quelante de íons cálcio, facilitando posteriormente a retirada dos zooides. Após o desaparecimento das espículas, os cortes imersos em EDTA foram transferidos para uma placa de Petri com água, sendo realizada a retirada dos zooides como descrito anteriormente e feita a dissecação e análise de suas estruturas internas em microscópio estereoscópio.
Vale ressaltar que uma tesoura para microcirurgia foi utilizada em procedimentos com pequenas estruturas, tais como faringe e estômago de zooides. Além disso, o corante Hematoxilina de Harris foi empregado em organismos com pouco contraste e glicerina para que fosse diminuída a opacidade dos zooides.
As espículas calcárias observadas na família Didemnidae foram analisadas por imagens obtidas através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) na Central Analítica da Universidade Federal do Ceará. As amostras das estruturas calcárias foram preparadas por meio da incineração de um pequeno pedaço da colônia com auxílio de maçarico portátil, para que fosse retirada a parte orgânica do animal. Os resíduos da incineração foram lavados em uma pequena quantidade de etanol, e, em seguida, depositados em fita adesiva de carbono dupla face aderida a stubs. Essas amostras foram metalizados com partículas de ouro (20 nm), sendo posteriormente fotografadas.
2.4. Identificação
As estruturas externas e internas das colônias, zooides e larvas foram observadas e descritas para realizar a comparação com a literatura pertinente. Após a análise de cada espécime, foi utilizada a chave de identificação das famílias e gêneros para as ascídias do Atlântico (ROCHA; ZANATA; MORENO, 2012), em seguida, foram realizadas comparações com a literatura existente e a aplicação da chave de identificação para as espécies de ascídias do Golfo do México proposta no segundo capítulo desse trabalho. Foi feito o registro fotográfico de parte dos exemplares em laboratório, assim como a ilustração de alguns dos animais.