A identificação dos espectros de RMN permitiu a identificação de, no total, 75 metabólitos, incluindo açúcares, aminoácidos, intermediários de vias metabólicas, ácidos orgânicos, nucleotídeos e cofatores (Anexo I). Os perfis dos metabólitos identificados foram primeiro comparados por análise de componente principal (PCA) seguida de clusterização hierárquica. A PCA é uma análise multivariada de grande relevância para a condensação de um grande número de variáveis existentes em um conjunto de dados, e fornece uma visão geral das relações entre estas variáveis e as amostras (BRO; SMILDE, 2014). A combinação da PCA com a clusterização permitiu avaliar a reprodutibilidade das réplicas biológicas, verificar padrões de similaridade entre as condições amostradas e identificar quais os principais metabólitos que mais influenciaram na variação dos dados (Figura 20). Dessa forma, duas réplicas outliers (T. reesei_glicose_#2 e A. niger_lactose_#1) foram identificadas e desconsideradas das análises posteriores.
As amostras de BEX também foram desconsideradas nas análises quantitativas, uma vez que elas não puderam ser normalizadas por massa como as demais amostras. Durante o crescimento em BEX, as hifas de T. reesei e A. niger permeiam a estrutura lignocelulósica de modo a formar um emaranhado praticamente inseparável de micélio e fibras. Por essa razão, é muito difícil isolar a biomassa dos fungos para avaliar o crescimento por massa seca e fazer a extração dos metabólitos unicamente do micélio. Apesar da massa ser padronizada para as extrações, não se sabe em qual proporção é encontrado o micélio dos fungos e o BEX residual utilizado como fonte de carbono. Portanto, o perfil de metabólitos encontrado para ambos os fungos em BEX será discutido separadamente e apenas qualitativamente.
Figura 20. Análise comparativa do perfil metabólico encontrado nas amostras de T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc, G), CMC e lactose (Lac, L). A) PCA de dois componentes mostrando o agrupamento entre as condições amostradas por similaridade de perfil metabólico. Quanto maior a distância entre as amostras, maior a diferença dos perfis de metabólitos. Os círculos pontilhados e as elipses de diferentes cores indicam os três grandes grupos formados e as regiões com mais de 95 % de confiabilidade, respectivamente. B) Dendograma da clusterização hierárquica das amostras.
A análise de dois componentes revelou claramente a existência de três grandes grupos de amostras que foram separadas principalmente pela fonte de carbono (Figura 20A). Em outras palavras, as diferenças dos perfis entre os fungos crescidos nas mesmas condições de crescimento foram menores do que as causadas pelas fontes de carbono. O primeiro componente (PC1) foi responsável por mais da metade (55,7 %) de toda variação biológica encontrada, e segregou as amostras dos fungos crescidos em lactose das demais condições de crescimento. As amostras de CMC e glicose estiveram mais próximas entre si no PC1. O segundo componente (PC2) respondeu por 22,9 % dessa variação, e separou as amostras de modo a formar os três grupos de substratos bem definidos (Figura 20A). Os dois componentes juntos responderam por 78,6 % da variação do conjunto de dados, e por essa razão não foram adicionados outros componentes na análise de PCA.
O dendrograma das amostras clusterizadas corroborou as diferenças apontadas pela análise de PCA. As amostras biológicas foram consistentes para as mesmas condições de crescimento, e as amostras de lactose foram as mais distingas em relação às demais fontes de carbono (Figura 20B). É curioso notar que as maiores diferenças foram observadas entre as fontes de carbono, e não entre os fungos. T. reesei e A. niger pertencem às classes Sordariomycetes e Eurotiomycetes, respectivamente, e evoluíram de forma independente ao longo do tempo (SCHOCH et al., 2009; BEIMFORDE et al., 2014). Portanto, acreditava-se que ambos os fungos pudessem divergir em relação ao perfil metabólico avaliado nas condições deste estudo. No entanto, apesar dos caminhos evolutivos serem diferentes, T. reesei e A. niger apresentaram vários metabólitos em comum, sugerindo a adoção de estratégias parecidas para crescerem e se adaptarem às fontes de carbono avaliadas.
O perfil dos metabólitos encontrados por heatmap mostrou que apenas um pequeno número foi observado nas amostras controle (meio de cultivo sem fungo) (Anexo II). Dentre eles, destacam-se: glicose, maltose e frutose (controle glicose); glucarato, galactose e lactose (controle lactose); e N-acetilglicosamina (controle CMC) (Anexo II). Praticamente todos estes metabólitos fazem parte da composição dos meios de cultivo nos quais foram crescidos os fungos T. reesei e A. niger, e, portanto, sua identificação na análise dos perfis metabólicos já era esperada.
A seguir, foram investigados os metabólitos que mais contribuíram para as diferenças observadas nas análises anteriores. Especificamente para o PC1, os metabólitos com valores maiores de score foram lactose, glucitol (sorbitol), galactitol, 2-fosfoglicerato e
galactose; e os menores, serina, frutose, prolina e glucarato (Figura 21, Anexo III). O grupo de metabólitos com valores maiores respondeu por boa parte da segregação das amostras de lactose à direita, enquanto que o grupo dos valores menores, pelas demais amostras à esquerda (Figura 21). Lactose, glucitol, galactitol e galactose são metabólitos do metabolismo da lactose, e, portanto, é evidente sua maior contribuição para a variação das amostras nesta fonte de carbono. Por outro lado, os metabólitos com menores valores de score foram encontrados quase que exclusivamente em CMC e glicose, como observado pelos gráficos da frutose e serina ao lado do PCA (Figura 21, Anexo III).
Figura 21. Distribuição dos scores dos principais metabólitos responsáveis pelas diferenças encontradas entre T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc), CMC e lactose (Lac). Os metabólitos destacados em laranja e vermelho, e verde e azul apresentaram os maiores e menores valores de score para o primeiro e segundo componente, respectivamente. A fim de exemplificar, é mostrada a abundância normalizada pela massa de apenas alguns dos metabólitos com maiores e menores valores de score ao lado do gráfico do PCA.
Em relação ao PC2, homoserina, 2-fosfoglicerato e glutationa foram os metabólitos com maiores valores de score, enquanto que celobiose, glicolato e galactarato, os menores (Figura 21, Anexo III). Estes metabólitos apresentaram perfis de concentrações bastante diferentes: os de maior valor de score foram encontrados quase que exclusivamente em glicose e lactose, ao passo que os de menor foram encontrados em maior abundância em CMC (Figura 21, Anexo I).
Analisando globalmente a concentração dos metabólitos em ambos os fungos (Figura 22), é possível verificar similaridades nos perfis com alguns metabólicos se destacando dos demais pela maior abundância nas condições amostradas. Notavelmente, manitol, trealose, GABA (4-aminobutirato), glicerol-3-fosfocolina e os aminoácidos glutamina, alanina e glutamato foram os metabólitos mais abundantes em ambos os fungos crescidos em glicose, CMC e lactose (Figura 22, Anexo I). Manitol e trealose são produzidos normalmente nas células de fungos como forma de reservas de carboidrato e energia. São de extrema relevância para o desenvolvimento de fungos e atuam como moléculas protetoras contra diversos tipos de estresse (MEENA et al., 2015). Como mostrado adiante, manitol e trehalose também foram os metabólitos mais abundantes em T. reesei e A. niger crescidos em BEX. GABA é um aminoácido não proteico formado a partir da descarboxilação de glutamato e com papel central na via GABA shunt que desvia o fluxo de carbono do ciclo TCA para formar semialdeído succínico e succinato. Esta via é energeticamente menos eficiente que o ciclo TCA e não gera um ganho de ATP ou NADH para a célula, tendo assim um papel ainda não totalmente compreendido no metabolismo de fungos (MEAD et al., 2013). Além da via GABA shunt, GABA atua sobre a germinação dos conidiósporos e pode servir como fonte de nitrogênio para fungos (KUMAR; PUNEKAR, 1997). É ainda produzido em resposta a vários estresses e em condições limitadas de disponibilidade de fonte de carbono (BÖNNIGHAUSEN et al., 2015a; SHELP; BOWN; ZAREI, 2017). Glicerol-3-fosfocolina está envolvido no metabolismo de fosfolipídeos que compõem as membranas celulares, enquanto que glutamina, alanina e glutamato participam ou são moléculas precursoras de várias vias bioquímicas, como metabolismo de histidina, glutationa, nitrogênio e purina (database KEGG). A presença destes metabólitos em grandes concentrações nas quatro fontes de carbonos sugere um core de metabólitos imprescindível para o crescimento de T. reesei e A. niger (Figura 22, Anexo I).
Figura 22. Heatmap dos metabólitos identificados em T. reesei (Tr) e A. niger (An) crescidos em glicose (Gluc), CMC e lactose (Lac). Os valores das concentrações dos metabólitos foram normalizados pela opção “autoscale samples” e são apresentados em log2. Metabólitos mais e menos abundantes são mostrados em vermelho e azul,
respectivamente.
Glicerol foi outro metabólito muito abundante em glicose, CMC e lactose (Figura 22, Anexo I). Este metabólito faz parte da composição básica dos fosfolipídeos de membrana, conectando uma molécula de fosfato a duas cadeias de ácido graxo. Possui função de reserva de energia e atua também como protetor contra estresses (KLEIN et al., 2017; RIES et al., 2018b). Outro metabólito em comum para ambos os fungos foi o 2- fosfoglicerato, um dos intermediários finais da via glicolítica. 2-fosfoglicerato estava em
maiores concentrações principalmente em glicose e lactose, que são fontes de carbono mais fáceis de serem assimiladas e convertidas em energia em relação à CMC. Assim é esperado que a via glicolítica esteja mais ativa em substratos menos complexos em termos de estrutura e composição química. Apesar de a lactose estar presente no meio de cultivo (Anexo II) e poder influenciar o conteúdo dos metabolomas de T. reesei e A. niger – ainda que os micélios de ambos fungos tenham sido lavados antes de serem macerados – foi observada uma alta concentração desse açúcar em ambos os fungos, alcançando valores de log2 igual a 13 (Anexo I). Essa concentração já era esperada uma vez que, ao contrário do
que se pensava que T. reesei apenas clivava lactose extracelularmente (SEIBOTH et al., 2007), dois grupos de pesquisa identificaram e caracterizaram uma lactose permease (Crt1, jgi|3405) capaz de transportar lactose para dentro da célula, e com papel essencial sobre a indução de celulases em T. reesei crescido neste açúcar (IVANOVA et al., 2013; ZHANG et al., 2013). No mesmo ano, pelo menos mais duas permeases de lactose foram descobertas em T. reesei (jgi|77517 e 79202) (PORCIUNCULA et al., 2013). Dessa forma, nossos dados sugerem que a lactose foi de fato internalizada por T. reesei, ao invés de ser primeiro clivada em glicose e galactose para depois serem assimiladas.
Curiosamente, não houve diferença significativa (teste t-student, FDR < 0,05) entre os níveis de lactose encontrados no metaboloma de T. reesei e A. niger (Figura 22, Anexo I). Já é bem reportado na literatura que lactose e galactose não são as fontes de carbono preferenciais de A. niger, como observado pelas menores taxas de crescimento em relação a T. reesei e A. nidulans (STEINBERG, 1939; FEKETE et al., 2012). Em A. niger, o transporte de galactose não ocorre nos conidiósporos, mas sim no micélio, sendo, portanto, dependente do estágio de crescimento do fungo (FEKETE et al., 2012). Ainda que A. niger cresça mais vagarosamente que T. reesei em lactose (dados não mostrados) e não tenha ainda nenhum transportador de lactose descrito, o açúcar deve estar sendo assimilado por transportadores ainda não identificados e caracterizados, caso contrário não seria possível quantificar lactose no metaboloma intracelular do fungo (Figura 22). Recentemente, PENG e colaboradores (2018) realizaram uma análise in silico para investigar novos transportadores de açúcar em A. niger, e identificaram um transportador (An07g01310) sendo induzido por lactose. Este transportador poderia então fazer o uptake de lactose para o meio intracelular dos conidiósporos de A. niger. Alguns transportadores de lactose também já foram caracterizados em A. nidulans, como LacpA e LacpB (KULCSÁR et al., 2016). A busca pelos
ortólogos dos seus genes em A. niger apontou lac12 (An12g09270) como sendo o candidato mais provável para ambos os transportadores (AspGD, (ARNAUD et al., 2012). Apesar do trabalho publicado por nosso grupo (BORIN et al., 2017) e por SOUSA e colaboradores (2011) terem mostrado a hiper-expressão de lac12 em A. niger crescido em bagaço explodido de cana, seu papel de transportador permanece elusivo.
Galactose e galactitol foram mais abundantes significativamente (teste t-student, FDR < 0,05) em T. reesei do que A. niger, quando crescidos em lactose (Figura 22, Anexo IV). Uma das razões para estas diferenças significativas é que, apesar de ambos os fungos terem as principais vias de catabolismo de galactose, que convertem galactose a galactose-1- fosfato (via de Leloir) ou a galactitol (via oxidoredutiva) (SEIBOTH et al., 2007; MOJZITA et al., 2012), T. reesei possui uma taxa de crescimento maior em galactose (FEKETE et al., 2012). Essa habilidade metabólica pode favorecer então o catabolismo de lactose na geração de energia e, consequentemente, promover o maior crescimento de T. reesei. A. niger de fato mostrou um menor crescimento em massa seca quando crescido em lactose em relação a T. reesei (dado não mostrado).
Finalmente, o dissacarídeo celobiose formado a partir da hidrólise das cadeias de celulose foi encontrado nas amostras de T. reesei e A. niger crescidos em CMC (Figura 22, Anexo I). A presença deste metabólito já era esperada no metaboloma destes dois fungos, uma vez que suas celulases, especialmente celobiohidrolases, liberam celobiose que será transportada e clivada em duas moléculas de glicose para entrar na via glicolítica.