A imunoexpressão do VEGF, VEGFR-1/flt-1 e VGFR-2/flk-1 foi analisada no endométrio de cadela durante o ciclo éstrico e na gestação inicial. O crescimento vascular é necessário para a proliferação e reparação do endométrio durante o ciclo éstrico, e durante a preparação do mesmo para a implantação e placentação de um potencial embrião (Torry et al, 1997). A imunomarcação do VEGF e recetores – flt-1 e flk-1 – foi observada em todas as fases do ciclo éstrico e na gestação inicial de cadela. Encontrou-se também expressão destas três moléculas em todas as estruturas uterinas estudadas – epitélio de superfície, glândulas superficiais, glândulas profundas, estroma e miométrio. Durante a gestação inicial, foi também observada imunomarcação do VEGF e recetores na placenta – citotrofoblasto, sinciciotrofoblasto e lacunas. A percentagem, intensidade e padrão de marcação apresentaram variação ao longo das fases do ciclo éstrico e da gestação.
A imunomarcação foi detetada em exclusivo no citoplasma e membrana citoplasmática, embora com diferentes padrões de distribuição espacial, nos três marcadores. As observações efetuadas neste trabalho vão ao encontro ao referido em outros estudos, nomeadamente os resultados obtidos por Sağsöz et al (2013). Estes autores referem que a marcação imunohistoquímica positiva foi observada exclusivamente no citoplasma e membrana citoplasmática das células epiteliais de superfície e glandulares, estromais e musculares. A intensidade de marcação variou ao longo das fases do ciclo éstrico (Sağsöz et al, 2013). No nosso estudo, a percentagem e intensidade de marcação dos três marcadores foi maior nos epitélios de superfície e glandular do que no estroma e miométrio, em qualquer das fases do ciclo éstrico, coincidindo com o observado por Sağsöz et al (2013).
O VEGF é um potente fator angiogénico, função evidenciada em diferentes experiências com alteração do VEGF e seus recetores. Para uma correta vasculogénese e angiogénese durante o desenvolvimento do organismo, é necessária a expressão dos dois alelos desta proteína (Torry et al, 1997). A deleção dos dois alelos do VEGF ou a presença de genes knockout do VEGFR-1 e VEGFR-2 originam mortalidade embrionária por defeitos vasculogénicos e angiogénicos em ratos (Cross et al, 2001; Charnock-Jones et al, 2004; Ho et al, 2007; Roskoski Jr., 2008). A promoção ou inibição da angiogénese está dependente de um elevado número de fatores de crescimento, sendo que a família VEGF não é a única responsável pelo crescimento vascular do endométrio e placenta (Torry et al, 1997).
Os vasos sanguíneos do sistema reprodutor feminino, com as respetivas alterações morfológicas e funcionais cíclicas fisiológicas, sofrem uma remodelação influenciada
por diversos fatores de crescimento, entre os quais o VEGF (Sağsöz et al, 2013). A expressão deste marcador foi avaliada nos ovários de cadela que demonstram a sua influência na formação das estruturas foliculares ováricas, em resposta às alterações hormonais (Abdel-Ghani et al, 2014).
Neste estudo, a expressão do VEGF e seus recetores aumentou, tanto a nível de percentagem de marcação como de intensidade, no estro e no diestro comparativamente às fases de anestro e proestro. Estas diferenças, que foram consideradas estatisticamente significativas, estão relacionadas com a influência hormonal a que o endométrio é submetido (Charnock-Jones et al, 2004; Allen et al, 2007; Chowdhury et al, 2010; Sağsöz et al, 2013; Lai et al, 2015).
A influência do estrogénio e progesterona está diretamente relacionado com a expressão do VEGF e também dos seus recetores. Os esteróides sexuais e outros fatores angiogénicos regulam a vascularização durante o ciclo menstrual na mulher; foi demonstrado que a concentração de VEGF aumenta três vezes na fase secretora (progestagénica) relativamente à fase proliferativa (estrogénica), o que está de acordo com os dados por nós obtidos (Zygmunt et al, 2003). Estrogénio e progesterona atuam sobre a regulação do VEGF no útero de ratos e primatas. Nas ovelhas, ratos gestantes e humanos a excreção de VEGF é principalmente estimulada pelo estrogénio (Allen et al, 2007; Sagsöz et al, 2011).
Neste estudo, verificou-se o aumento da imunoexpressão do VEGF e recetores com o aumento dos níveis de progesterona, a partir da fase de estro, sugerindo que a família VEGF tem um papel de modulador autócrino e parácrino do crescimento e remodelação vascular, e da permeabilidade vascular do endométrio. Este aumento da expressão do VEGF coincide com períodos de proliferação das células endoteliais (Torry et al, 1997).
Em várias espécies, os níveis de expressão do VEGF, flt-1 e flk-1 foram identificados nos folículos ováricos, apresentando diferenças ao longo das fases do ciclo éstrico, por exemplo, na ovelha. A expressão é maior durante e após o pico de LH, comparativamente com a fase lútea e a fase prévia ao pico de LH (Chowdhury et al, 2010) e em ratos ovarioectomizados, nos quais a expressão de VEGF uterino foi induzida, após administração de estrogénios (Torry et al, 1997).
Os efeitos biológicos do VEGF são mediados através de três recetores membranares específicos: o recetor 1 (VEGFR-1 ou Flt-1), o recetor 2 (VEGFR-2, KDR ou Flk-1), e o recetor 3 (VEGFR-3 ou Flt-4) (Cross et al, 2001; Byrne et al, 2005). O VEGFR3 tem como principal papel a remodelação do plexo capilar primário do embrião e contribui
para a angiogénese e linfangiogénese no adulto (Roskoski Jr., 2008). Este recetor não foi alvo de estudo neste trabalho.
O recetor flk-1 é o mediador predominante da atividade do VEGF – migração, proliferação e sobrevivência das células endoteliais e no aumento da permeabilidade vascular. Este recetor tem menor afinidade para o VEGF do que o flt-1, contudo demonstra maior atividade na resposta ao VEGF (Roskoski Jr., 2008).
Foi na expressão do VEGF que observámos as maiores diferenças estatísticas nas fases do ciclo éstrico estudadas. A resposta desta molécula à influência hormonal aparenta ser mais marcada do que a expressão dos seus recetores. Observou-se também que, os recetores flt-1 e flk-1 apresentaram maior imunoexpressão comparativamente com o VEGF. A maior intensidade de marcação dos recetores poderá estar relacionada com o seu armazenamento intracitoplasmático e reciclagem até à superfície celular aquando da resposta à estimulação pelo VEGF (Gampel et al, 2006).
O VEGF apresentou marcação citoplasmática difusa e acumulado no citoplasma em vesículas, por nós designadas em dot (ponto, mancha), contrastando com os recetores que apresentaram maioritariamente expressão com padrão citoplasmático difuso. Estas diferenças observadas no padrão de expressão poderão ser explicadas pela via de produção e excreção celular destas moléculas. O padrão dot poderá ser sugestivo de armazenamento do VEGF no complexo de Golgi para um eventual transporte para a superfície enquanto a distribuição citoplasmática difusa dos recetores poderá estar relacionado com o armazenamento destas proteínas em vesículas endossómicas no citoplasma (Gampel et al, 2006).
A alteração do padrão de marcação ao longo das fases do ciclo éstrico sugere a regulação autócrina do VEGF sobre os recetores nas células epiteliais. O padrão dos recetores passou de citoplasmático difuso nas fases estrogénicas para maioritariamente citoplasmático com reforço membranar nas fases progestagénicas. Esta alteração pode estar relacionada com o transporte dos recetores nas vesículas citoplasmáticas até à membrana celular, local onde os recetores atuam.
Verificámos expressão dos marcadores analisados nas células estromais e musculares, tanto na membrana plasmática como no citoplasma destas células, e no endotélio dos vasos sanguíneos. A marcação dos vasos sanguíneos não permitiu a distinção da maturidade destes, pois não se observaram diferenças de expressão do VEGF e recetores nos vasos de diferentes calibres. Contudo, a expressão destes
marcadores nos vasos sanguíneos foi mais intensa do que com outros marcadores vasculares testados durante a preparação deste trabalho (dados não apresentados). Relativamente à expressão dos dois recetores, flt-1 e flk-1, foi observado que ambos têm um comportamento semelhante durante as fases do ciclo éstrico e gestação. Fisiologicamente, o equilíbrio entre a expressão destes marcadores é necessário para o correto desenvolvimento dos vasos sanguíneos e do próprio organismo (Ferrara, 2004).
O aumento de expressão dos marcadores pró-angiogénicos a partir da fase de estro correlaciona-se com a necessidade fisiológica da preparação do útero para uma potencial gestação. Vasculogénese e angiogénese são essenciais para a sobrevivência do embrião e placenta, pois o seu crescimento depende da formação da rede vascular materna e fetal, assim como do aumento de aporte sanguíneo durante a gestação (Zygmunt et al, 2003; Charnock-Jones et al, 2004; Breen, 2007; Sağsöz et al, 2013). Durante a gestação, o VEGF estimula a proliferação das células endoteliais e aumenta a permeabilidade vascular. Este fator de crescimento foi identificado em úteros gestantes de mulher, rato, coelho, ovelha e porca (Schafer-Somi et al, 2013) e cadela (Sağsöz et al, 2013).
Relativamente à placenta, os níveis de expressão do VEGF, flt-1 e flk-1 foram, na generalidade, maiores do que no ciclo éstrico, o que está de acordo com o observado na literatura em outras espécies (Winther et al, 1999; Allen et al, 2007; Sagsöz et al, 2011). A necessidade do aumento do aporte sanguíneo para uma gestação normal justifica o incremento da imunoexpressão destes marcadores. O predomínio de progesterona durante esta etapa atesta a sua influência na presença dos fatores angiogénicos.
O VEGF atingiu a sua máxima expressão no período de pré-implantação, estando relacionada com o aumento da regulação durante a fase de gestação na cadela, comparável com ratos gestantes. O recetor flk-1 exibiu o mesmo comportamento, demonstrando uma importante expressão durante a gestação inicial (Schafer-Somi et al, 2013).
A marcação intensa do VEGF, flt-1 e flk-1 observada nas células das estruturas placentárias (citotrofoblasto, sinciciotrofoblasto e lacunas) coincide com o rápido crescimento e desenvolvimento do embrião nas fases iniciais da gestação, comparável com outras espécies descritas na literatura (Winther et al, 1999).
A imunoexpressão do VEGF e recetores na fase inicial de gestação na cadela é comparável à expressão destes fatores durante o diestro (Schafer-Somi et al, 2013), sendo considerada elevada relativamente às restantes fases do ciclo reprodutivo da cadela. Esta situação pode ser explicada pela influência hormonal idêntica que ocorre na cadela durante a fase de diestro e gestação, sendo que em ambas a progesterona é a hormona dominante (Concannon, 2011).
A desregulação da formação e crescimento de vasos sanguíneos é um dos principais focos da investigação científica no tratamento das doenças neoplásicas, sendo que os fatores de crescimento como o VEGF são alvo de estudo, como forma de inibir o desenvolvimento de tumores (Cross et al, 2001). Alterações da expressão do VEGF e seus recetores estão também na origem de determinadas doenças no Homem. A expressão do VEGF encontra-se alterada, na mulher, em doenças como a pré- eclampsia, síndrome do ovário poliquístico, aborto espontâneo (Zygmunt et al, 2003; Lai et al, 2015). Na mulher, por exemplo, o excesso de VEGFR-1 está relacionado com a pré-eclampsia (Roskoski Jr., 2008), situação que pode dar origem a enfartes por aumento da pressão arterial. Quando se verifica o equilíbrio da expressão das moléculas da família do VEGF, este poderá estar relacionado com o desenvolvimento adequado da placenta devido ao papel trófico e de proteção (antiapoptótico) das mesmas (Breen, 2007),