Contrôle transcriptionnel des gènes effecteurs de la résistance aux azoles

Nous avons vu plus haut que l’expression des gènes effecteurs de la résistance clinique aux azoles est sous le contrôle de facteurs de transcription à doigts de zinc de la famille zinc cluster chez C. albicans. Nous avons vu aussi, plus précisément, l’importance du régulateur Mrr1p dans le contrôle transcriptionnel de MDR1. Des études antérieures dans notre laboratoire ont aussi révélé l’implication d’un autre facteur de transcription, appelé Cap1p, dans la régulation de ce gène (Alarco et Raymond, 1999), mais jusqu’à présent aucune étude n’a démontré son implication dans la résistance clinique (i.e. l’existence d’altérations affectant Cap1p ou affectant des composantes contrôlant son activité ayant lieu dans des souches de C. albicans isolées de patients). Cap1p est un facteur de transcription de la famille basic-leucine zipper (bZIP) et est l’homologue fonctionnel de Yap1p chez S. cerevisiae (Alarco et al., 1997;Alarco et Raymond, 1999). Je vais, d’abord, détailler la structure et fonctions des facteurs de transcription zinc cluster chez C. albicans, ensuite résumer les fonctions de Cap1p et son rôle dans la régulation de l’expression du gène MDR1.

I.5.1. Les facteurs de transcription à doigts de zinc du type zinc cluster :

Structure et fonctions chez Candida albicans

Plusieurs études, chez S. cerevisiae notamment, ont montré que la famille des facteurs de transcription zinc cluster est impliquée dans le contrôle transcriptionnel de gènes impliqués dans une variété de processus métaboliques et de mécanismes de réponse aux stress, comme la carence en éléments nutritifs ou la présence de produits toxiques et

xénobiotiques (MacPherson et al., 2006). Certains régulateurs zinc cluster chez S.

cerevisiae, comme Pdr1p, Pdr3p, Yrr1, Yrm1 et Pdr8p, contrôlent la résistance aux

antifongiques et aux dérivés xénobiotiques (MacPherson et al., 2006). Cette famille de régulateurs est exclusivement fongique et le génome de C. albicans en encode 78 membres (Braun et al., 2005). Cette section de la thèse est structurée sous la forme d’une revue de la littérature sur les facteurs de transcription de la famille zinc cluster chez C. albicans, récapitulant leur structure et fonctions (voir chapitre 6).

I.5.2. Régulation de l’expression du gène MDR1 par le facteur de

transcription bZIP Cap1p

Cap1p est l’homologue fonctionnel du facteur de transcription Yap1p chez S.

cerevisiae (Alarco et al., 1997;Alarco et Raymond, 1999). Yap1p est un régulateur majeur

de la réponse au stress oxydatif chez la levure à bourgeon et est membre de la famille bZIP des facteurs de transcription, tout comme l’oncogène c-jun chez les mammifères (Moye- Rowley et al., 1988;Moye-Rowley et al., 1989). Yap1p se lie via son domaine amino- terminal bZIP (Figure I-11A) à des séquences de reconnaissance appelées Yap1 recognition elements (YRE), TTA(C/G)T(A/C)A, retrouvées dans les promoteurs de ses gènes cibles (Nguyen et al., 2001) et contrôle l’expression de gènes encodant la majorité des antioxydants et des thiol-oxydoréductases comme la glutathione réductase GLR1 et la thiorédoxine réductase TRR1 (Herrero et al., 2007;Moye-Rowley, 2003). Yap1p est aussi requis pour la réponse au stress induit par les métaux comme le cadmium et peut-être activé par des composés chimiques comme le diamide, des agents antifongiques comme le bénomyl, les radiations ionisantes, des métabolites endogènes toxiques comme le méthylglyoxal (Alarco et al., 1997;Maeta et al., 2004;Molin et al., 2007). Notamment, une étude de notre laboratoire a montré que Yap1p régule l’expression de FLR1, encodant l’homologue fonctionnel de MDR1 de C. albicans (Alarco et al., 1997).

Des études ayant pour but de décortiquer le mécanisme d’activation de Yap1p ont montré que Yap1p utilise un mécanisme remarquable, exploitant l’oxydation de l’acide aminé cystéine, pour réguler l’expression de ses gènes cibles en réponse au stress oxydatif. Yap1p possède des domaines senseurs des niveaux d’oxydants dans la cellule, représentés par des domaines riches en résidus cystéine (cysteine-rich domain, CRD, Figure I-11A) : un domaine CRD retrouvé au centre de la protéine (n-CRD, n pour N-terminal) et un autre à l’extrémité C-terminale (c-CRD) (Figure I-11A). Le domaine C-terminal coïncide avec la séquence signal d’export du noyau (Nuclear Export Signal, NES) qui médie l’interaction avec l’exportine nucléaire Crm1p (Figure I-11B). En dehors de toute condition activatrice de Yap1p, ce dernier se retrouve localisé principalement au niveau du cytoplasme. Cette localisation cytoplasmique est déterminée par l’export constitutif de Yap1p du noyau qui est plus actif que l’import au noyau, grâce notamment à la fonction de l’exportine Crm1p. En réponse au stress oxydatif, un pont disulfure est généré entre la cystéine 303 (n-CRD) et la cystéine 598 (c-CRD), masquant ainsi la NES et prévenant l’interaction avec Crm1p ce qui mène à une rétention nucléaire et l’activation de l’expression des gènes cibles de Yap1p (Figure I-11B) (Herrero et al., 2007;Kuge et al., 1997;Kuge et al., 1998;Kuge et al., 2001).

Figure I-11. Mécanisme d’activation de Yap1p chez S. cerevisiae. A. Représentation schématique (barres bleues) des structures primaires des protéines Yap1p de S. cerevisiae (650 acides aminés) et Cap1p de C.

albicans (499 acides aminés). Le domaine de liaison à l’ADN du type basic leucine-zipper (bZIP, rectangle

jaune-orange) sont délimitées par les positions des acides aminés correspondants indiqués en bas. Les domaines riches en cystéine (rectangles blancs) sont retrouvés à la partie centrale (n-CRD) et à l’extrémité C- terminale (c-CRD) de la protéine Yap1p. Cap1p possède un domaine CRD à l’extrémité C-terminale et deux cystéines conservées (sphères rouges) à la partie centrale. Le domaine c-CRD inclut un signal d’export nucléaire (NES) médiant l’interaction avec l’exportine Crm1p (Herrero et al., 2007). B. Panneau de gauche, Durant des conditions normales de croissance, Yap1p est exporté en dehors du noyau suite à l’interaction du signal NES avec Crm1p. Panneau de droite, Lors d’un stress oxydatif, l’oxydation des cystéines 598 du domaine c-CRD et cystéine 303 du domaine n-CRD mène à la formation d’un pont disulfure qui prévient l’interaction de l’exportine Crm1p avec le signal NES. Ceci a pour conséquence une rétention nucléaire et l’augmentation de l’activité transcriptionnelle des gènes cibles de Yap1p (Herrero et al., 2007).

La première caractérisation de Cap1p a été effectuée dans notre laboratoire, avec la démonstration que CAP1 conférait la résistance au fluconazole en le surexprimant chez S.

cerevisiae (Alarco et al., 1997). La résistance au fluconazole est médiée par FLR1 chez S. cerevisiae qui encode l’homologue fonctionnel de Mdr1p. CAP1 complémentait la fonction

de YAP1 dans des cellules yap1Δ (Alarco et al., 1997). La délétion de CAP1 dans une souche sensible aux azoles de C. albicans et la réintroduction de l’allèle dans la souche mutée n’ont pas d’effet sur la susceptibilité à cet antifongique (Alarco et Raymond, 1999). Par contre, l’expression d’une version tronquée de Cap1p (Cap1p-TR) isolée dans le criblage chez S. cerevisiae ne possédant pas les derniers 165 acides aminés C-terminaux, incluant le domaine CRD équivalent du c-CRD de Yap1p, conférait une résistance significative au fluconazole comparativement à l’expression de l’allèle du type sauvage (Alarco et Raymond, 1999). Cette résistance corrèle avec une surexpression constitutive de

MDR1 (Alarco et Raymond, 1999), suggérant que ce gène effecteur de la résistance

clinique aux azoles est une cible directe ou indirecte de Cap1p et que CAP1-TR est une version hyperactive de Cap1p. Des études, ayant pour but de comprendre la régulation transcriptionnelle de MDR1, ont démontré l’importance de séquences ressemblant à des YREs dans l’induction de l’expression du gène MDR1 par le bénomyl ou le H2O2 (Harry et al., 2005;Hiller et al., 2006;Rognon et al., 2006). En particulier, la présence de deux

séquences TTA(C/G)TAA faisant partie des éléments de régulation agissant en cis du promoteur de MDR1, localisés entre -561 et -520 par rapport au codon initiateur de MDR1, étaient requis pour l’induction de MDR1 de façon dépendante de CAP1 suite au traitement par le H2O2 (Rognon et al., 2006).

Plusieurs caractéristiques de Cap1p de C. albicans convergent vers l’idée que cette protéine subit le même mécanisme d’activation que celui de Yap1p chez S. cerevisiae. Les structures primaires de Cap1p et Yap1p sont similaires, avec une homologie de séquence significative, surtout à la partie C-terminale de la protéine, et la conservation des domaines fonctionnels clés (Figure I-11A) (Alarco et al., 1997). La délétion de CAP1 dans

une souche de laboratoire de C. albicans, tout comme une délétion de YAP1 dans S.

cerevisiae, confère une hypersensibilité au cadmium, à l’oxyde de nitroquinoline (4-NQO)

et à la 1,10-phenanthroline, ce qui renforce la démonstration que ces deux protéines sont fonctionnellement homologues (Alarco et Raymond, 1999). Une étude a aussi démontré que la localisation nucléaire de Cap1p dépendait du stress oxydatif, avec une localisation diffuse dans toute la cellule en l’absence de traitement et une localisation nucléaire en présence de H2O2 (Zhang et al., 2000). La mutation de la cystéine conservée à la position

477 de Cap1p (C477A CAP1), qui équivaut à la cystéine 629 de Yap1p, phénocopie la mutation CAP1-TR, confirmant l’importance de l’intégrité du domaine CRD dans la réponse au stress oxydatif (Alarco et Raymond, 1999;Zhang et al., 2000). Tout comme lors de l’expression de CAP1-TR, l’expression de C477A CAP1 mène à des niveaux élevés des transcrits de la cible GLR1 (Alarco et Raymond, 1999;Zhang et al., 2000). Ces résultats démontrent que CAP1-TR, tout comme C477A CAP1, sont des versions hyperactives de

CAP1. Donc, par analogie au mécanisme d’activation de Yap1p chez S. cerevisiae, on

pouvait émettre l’hypothèse que la perte du domaine CRD de Cap1p ne permets plus l’accessibilité de l’exportine Crm1p, ce qui a pour conséquence une rétention nucléaire et une augmentation de l’activité transcriptionnelle.