3. MATERIEL ET METHODE
3.4. Contrôle de la greffe et du modèle
Le principal critère d’évaluation était la prise de la greffe à une semaine. En plus de l’évaluation clinique, une analyse microscopique par immunofluorescence de l’architecture et de la répartition cellulaire était réalisée. Les souris étaient sacrifiées en fin de procédure afin de réaliser l’analyse immunologique.
3 semaines après la greffe de peau, nous constations que l’architecture de la peau humaine était conservée. Comme dans les modèles de Hemmerling en 2011, et Racki en 2010, nous avons constaté une diminution de la densité en kératinocytes et fibroblastes par rapport aux explants témoins. Par ailleurs, un développement des structures vasculaires d’origine humaine et murine était observé, mais sans vascularisation lymphatique d’origine murine au sein de la greffe contrairement aux modèles précédents.
Pour ce qui est des cellules immunitaires, nous retrouvions une densité quasi semblable à celle des explants témoins pour ce qui concerne les APC résidentes (Langerhans CD1a+ et LT), les Lymphocytes T CD4+ et CD8+.
Figure 18 : Architecture et maintien des APC dans la peau humaine greffée et dans l’explant témoin.
Schéma représentant 2 techniques différentes de greffe de peau humaine (a). Pour la première, la peau humaine est entièrement recouverte par de la peau de souris, après une semaine l’épiderme est lysé. Pour la deuxième, la greffe de peau est placée bords à bords avec la peau de la souris et fixée par des points de souris. L’architecture cutanée est préservée à 1 et 3 semaines post greffe. Magnification x4, e : épiderme d : derme. Image d’une coupe de peau humaine réalisée par cryosection de 5µm à 1, 2, 3 et 4 semaines après la greffe. (b), Marquage au DAPI (bleu) et anti- CD1a humain (rouge), et anti β1 integrin (vert) humain (c) pour les explants 1 semaine après la greffe. Magnification x10, e : épiderme, d : derme. (d): Nombre de cellules CD1a+ dans le greffon humain après (w) 1, 2, 3 et 4 semaines après la greffe (n=4 dans chaque groupe).
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L’étape suivante a consisté à s’assurer du maintien de la fonctionnalité des APC au sein de nos greffes. Ainsi 4 heures après immunisation intradermique de la peau greffée, nous avons constaté que la prise en charge par différentes APC de nanoparticules-FITC (40 nm) par différentes DC (CD11c+, CD1a+ et HLA-DR+)était possible.
Ces mêmes APC capables de présenter l’Ag sont aussi capables d’induire une réponse spécifique par les LT CD8+. Pour prouver cela, nous avons utilisé un virus recombinant MVA codant pour la protéine Gag du VIH (MVA- HIVgag) que nous avons injecté en intradermique. Une fois l’injection faite, nous avons extrait les cellules dermiques et épidermiques des peaux humaines greffées, et les avons co-cultivés avec des cellules T CD8+ HIVgag spécifiques (aa 75- 83, SL9 peptide). La sécrétion de TNF et d’IFN, et d'IL-2, étaient ensuite mesurées en cytométrie de flux. Trois semaines après la greffe nous constations que les APC de la peau greffée étaient toujours présentes et fonctionnelles pour la présentation antigénique et pour l’induction d’une réponse T spécifique du MVA.
Nous avons ensuite voulu nous assurer de la persistance de cellules T Par la suite, nous avons réalisé des injections intradermiques avec le vaccin vivant atténué de la varicelle et le MVA. 48h après l’injection de MVA dans la peau humaine, nous constations une multiplication par 2 de la prolifération des LT CD4+ et CD8+ (évaluée par incorporation de BrdU in vivo). De même, l’injection intradermique du vaccin vivant atténué varicelle induit une sécrétion rapide et importante d’IFN et de TNF par les LT CD4+.
Figure 19 : APC et différentes voies de réponse immunitaire à un vaccin dans la peau humaine greffée
a. Maintenance of skin structure and CD1a+ LCs and dermal DCs 3 weeks after engraftment onto NSG
mice: 5 µm skin cryosections were immunostained with blue DAPI, human-CD1a (in red) and anti-human-1-integrin (in green) that lineated the epidermis (E), hair follicles (HF) and dermis (D). Scale bar = 50 m. b. Accumulation of FITC-NPs (in green) into dermis close to surrounding dermal cells, 4h after ID injection (1010 FITC-NPs). Scale bar = 100 m. c. FITC-NPs (green) are inside HLA-DR+ antigen presenting cells, CD11c+ and CD1a+ dermal DCs, 4h after ID administration: cells were extracted from skin graft by enzymatic and mechanical dissociation, coated on poly-L-lysine cover-slides and immunostained with anti-human-HLA-DR, CD11c or CD1a (in red) and blue DAPI. Scale bar = 5 m. d. Dermal and epidermal cell suspensions were recovered from HLA-A02 engrafted skin 4h after MVA-HIVgag (MVA, 1.107 pfu) or PBS ID injection (PBS). e. Dermal and epidermal cell suspensions from non-immunized graft were incubated for 4h with MVA-HIVgag (MVA, 1 pfu/cell), HIV-gag peptide (Pept, HIV gag SL9 peptide: SLYNTVATL, aa 75-83, 1g/mL) as positive control or not stimulated (PBS). SL9 clone 2, an HIV-specific CD8+ cytotoxic clone, was used to evaluate HLA class I antigen presentation efficacy after overnight co-culture with dermal or epidermal cells (ratio 1/1), IL-2, IFN and TNF
production by CD8+ T cells was monitored by intracellular staining and flow cytometry (n=3 mice for each condition, bar represent mean +/- SEM, *: p< 0.05, ***: p< 0.001 in non parametric t-test compared to PBS negative control).
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Figure 20 : Réponse immunitaire des LT humains de la peau greffée en présence d’antigènes
a, b. Maintenance of T cells within the epidermis (E) and dermis (D) 3 weeks after engraftment onto
NSG mice: 5 µm skin cryosections of engrafted (a) or non-engrafted (b) human skin were immunostained with anti-human-CD3 (clone SP7 thermo Scientific) and with Ultra View universal DAB chromogen (Ventana Medical System). Scale bar = 50 m c. Percentages of proliferating BrdU+ CD8 and CD4 T cells induced by intradermal injection of MVA in human skin graft, compared to non-treated control (Ctrl). Three weeks post-graft, 1.107 pfu of MVA (or PBS as control) were injected intradermally and NSG mice were injected intra-peritonealy 3 times 12 hours apart with 1 mg of BrdU. The following day, human skin cells suspension were recovered for flow cytometry staining, the percentages of BrdU+ within the live CD3+ CD8+ and CD4+ cell subsets in MVA ID treated skin graft (n=3) and untreated skin (Ctrl) (bars represent mean +/- SEM; one experiment representative of 2). d. TNF production by skin graft T cell in 4h after VZV intradermal vaccination (VZV-ID): 135 pfu/50 l of Varicella live-attenuated vaccine (Varivax® Sanofi Pasteur MSD) or saline buffer (PBS-ID), was injected into the skin graft by ID route. Intracellular cytokine staining was performed on skin cell suspensions, after overnight in vitro stimulation with VZV (13.5 pfu) or not (PBS). Dot plots show the percentages of TNF+ and CD8+ cells within the live CD3+ cell subset, for one representative experiment of 3.
Ainsi nous avons standardisé et fiabilisé notre technique de réalisation de souris humanisée par greffe de peau.
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TROISIEME PARTIE
Mise au point du modèle de souris humanisé par
injection de progéniteurs hématopoïétiques
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TROISIEME PARTIE : modèle de souris humanisé par injection de progéniteurs
hématopoïétiques
Le modèle de souris humanisé par injection de progéniteurs hématopoïétiques a fait l’objet d’un article scientifique publié. La publication complète est disponible en ANNEXE 1 de ce document.
1. CONTEXTE
Le modèle de souris humanisée par greffe de peau humaine est à présent un modèle fiable et reproductible. Néanmoins, il reste fastidieux à réaliser, et présente certaines limites, telles que la perte d’APCs au-delà de plusieurs semaines.
La difficulté d’obtention des explants, l’aspect chronophage et couteux des manipulations nous a poussé à envisager un nouveau modèle.
2. OBJECTIF
Ainsi nous avons tenté de mettre au point un nouveau modèle murin ou l’immunité cutanée humaine se ferait par colonisation de la peau de souris et non pas par greffe.
Dans ce modèle, les souris bénéficiaient d’injections intra-hépatiques de progéniteurs hématopoïétiques humains HLA-A2+CD34+. Une fois ces injections réalisées, il a fallu s’assurer que les tests vaccinaux permettraient d’obtenir une réponse immunitaire. Ceci n’étant pas le cas, il a fallu injecter aux souris des APCs provenant du même sang que les progéniteurs hématopoïétiques, qui étaient au préalable cultivé in vitro durant 3 jours en présence de hGM-CSF et d’IL-4.
Comme précédemment, nous avions par la suite pour objectif de valider le modèle en s’assurant que les populations cellulaires en APCs et lymphocytes de nos souris humanisées étaient équivalentes à celle de nos explants cutanés témoin.