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As estatinas são drogas hipolipemiantes que inibem a 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA (HMG – CoA) redutase, enzima responsável por catalisar a etapa inicial da biossíntese do colesterol, impedindo a síntese do mevalonato, levando a diminuição dos níveis séricos da lipoproteína de baixa densidade (LDL) (fig. 4) [80].

Figura 4. Mecanismo de ação das estatinas. As estatinas agem inibindo a HMG-CoA

redutase, enzima que converte o composto HMG-CoA à mevalonato. (Davignon and Leiter,

Algumas estatinas têm origem natural, isoladas a partir do metabolismo de fungos, como a mevastatina e a lovastatina. Já a pravastatina e a sinvastatina são derivados da lovastatina, enquanto que a atorvastatina, a cerivastatina e a fluvastatina são compostos sintéticos com estrutura química distinta das estatinas anteriores [81]. Ainda, as estatinas podem ser hidrofílicas como a pravastatina e a rosuvastatina, ou lipofílica como a atorvastatina, sinvastatina e a fluvastatina [82]. A estatina mais recente no mercado hoje é a pitavastatina, uma estatina sintética e lipofílica com propriedades farmacológicas distintas das outras estatinas, podendo oferecer maiores efeitos hipolipemiantes, mas não necessariamente maiores efeitos pleiotrópicos [83]. Além de sua ação como redutora do colesterol, as estatinas são conhecidas também por seus efeitos pleiotrópicos como anti-inflamatório, antioxidante, imunomodulador, antitrombótico, antiproliferativo e protetor do endotélio [84,85].

Acredita-se que o mecanismo pelo o qual as estatinas desenvolvem seus efeitos pleiotrópicos, seja pela via do mevalonato. Pois bloqueando a síntese dos isoprenóides, há uma menor expressão de substâncias inflamatórias, moléculas de adesão e do inibidor do ativador do plasminogênio tecidual (PAI) [86,87].

Assim, a redução do mevalonato melhora a disfunção endotelial, redução do estresse oxidativo, redução da adesão plaquetária e da formação de trombos [88].

Em virtude desses seus efeitos, Thomsen e colaboradores 2006, sugeriram que as estatinas poderiam ser úteis no auxílio ao tratamento da sepse e mostraram que a mortalidade de pacientes com sepse que não faziam uso de estatinas, foi cerca de duas vezes maior do que a de pacientes que faziam uso deste fármaco previamente a sua internação [89].

Já foi descrito que a pravastatina, além de reduzir as ações do radical hidroxila e peróxidos, também é capaz de diminuir a produção de H2O2

por monócitos de indivíduos saudáveis [90]. Franzoni et al 2003, identificaram que as estatinas possuem propriedade antioxidante intrínseca, tanto com atividade anti-hidroxila como anti radicais peróxidos [91].

Kitamoto et al 2004, observaram que a pravastatina alterou e reduziu o tamanho da placa aterosclerótica (independente da redução do colesterol),

através da diminuição de citocinas e de células inflamatórias nas lesões ateroscleróticas de macacos, concluindo que um mecanismo anti-inflamatório pode estar envolvido nesse resultado [92].

A estatina utilizada no nosso estudo foi a pravastatina, que é um fármaco ativo em sua forma de administração, hidrossolúvel com absorção de 30% a 50% da dose ingerida e com poucos efeitos colaterais. [87].

Portanto, diante dos estudos citados e considerando os efeitos pleiotrópicos que as estatinas apresentam, entre eles um significativo efeito anti-inflamatório, é de suma importância estudos sobre os efeitos destes fármacos frente a sepse com o objetivo de melhorar o tratamento deste quadro clínico

Figura 5. Estrutura química da pravastatina.

1.8 N-acetilcisteína

A N-acetilcisteína (NAC), é um agente oxidante que possui uma estrutura molecular simples, contendo um grupo tiol livre (figura 6). É um fármaco mucolítico e é amplamente utilizado na clínica há mais de quarenta anos. Teve seu primeiro uso terapêutico no tratamento de doenças pulmonares congestivas e obstrutivas associadas à hipersecreção de mucosa, como a bronquite crônica e fibrose cística [93].

A NAC é o principal tratamento da intoxicação com paracetamol caracterizada pela depleção grave de glutationa hepática (GSH) [94]. Além disso, é utilizada para a prevenção de nefropatia induzida por contraste e, recentemente estudos têm explorado o uso dela em vários distúrbios do sistema nervoso central decorrente do estresse oxidativo [95].

A NAC é um antioxidante que reduz eficientemente as espécies reativas de oxigênio (EROs) do organismo. Além de sua capacidade de sequestrar diretamente agentes oxidantes, exerce seu efeito antioxidante indiretamente, servindo como precursor para a síntese de glutationa, um antioxidante natural do corpo, protegendo de danos causando pelas EROs [93,96]. A glutationa, principal antioxidante do organismo, é sintetizada a partir do L-glutamato e L-cisteína que sofrem ação da enzima gama-glutamilcisteína sintetase levando a formação da L-γ- glutamilcisteína que, por sua vez, é convertida em glutationa na presença de glicina e da glutationa sintetase. A NAC quando desacetilada é convertida em cisteína, etapa limitante na síntese da glutationa [97,98]. A NAC pode se acumular no interior das células, onde é desacetilada e aprisionada no interior da mesma [99].

A NAC também é utilizada como ferramenta em estudos de estresse oxidativo e em processos inflamatórios como a sepse. O tratamento de camundongos com NAC diminui a expressão de moléculas de adesão em leucócitos e reduz a mortalidade dos animais na sepse experimental [100].

Também tem sido comprovado que a NAC inibe diferentes efeitos produzidos pelo LPS, incluindo diminuição da expressão de TLR4 em célula da musculatura lisa vascular [101] e da produção de TNF-α através da redução da geração de EROS e/ou aumento da produção de glutationa [102].

Martinez de Lizarrondo et al, 2017 demonstraram que a NAC promove dissolução do trombo quando administrada sistemicamente, especialmente em trombos ricos em plaquetas [103]. Acredita-se que essa ação da NAC é devida a seu grupo tiol livre, o qual reduz as ligações dissulfeto dentro de proteínas multiméricas, como o fator de Von Willebrand (FVW) [104].

Portanto, devido à necessidade clínica de agentes trombolíticos que possam desagregar os trombos arteriais sem aumentar significativamente o sangramento, o uso da NAC poderá fornecer um tratamento trombolítico

econômico adicional, novo e eficaz nas doenças trombolíticas envolvidas com o processo inflamatório.

A sepse é um quadro bastante complexo caracterizado por uma resposta inflamatória sistêmica que leva ao estresse oxidativo e o seu tratamento ainda é pouco efetivo, levando a um número grande de óbitos em todo o mundo. Nos últimos anos, evidências mostram que as plaquetas têm um papel importante na sepse, especialmente aumentando sua gravidade e assim, contribuindo para o incremento do índice de mortalidade. Portanto, considerando que as estatinas e a NAC apresentam um significativo potencial anti-inflamatório e antioxidante, respectivamente, este trabalho contribuirá na avaliação dos mecanismos de ação de diferentes fármacos e de utilização para um melhor tratamento dos pacientes com sepse.

Objetivos Gerais

• Avaliar o efeito da NAC e da pravastatina na formação de trombos arteriais em camundongos injetados com LPS.

Objetivos específicos

 Verificar o tempo de oclusão da carótida;

 Verificar o tempo de coagulação das vias intrínseca (TTPA) e extrínseca (TP);

 Quantificar os níveis de EROs no endotélio das carótidas lesionadas  Quantificar o número de plaquetas circulantes e na região do trombo  Analisar a presença de marcadores inflamatórios, I-CAM e P-selectina

Para execução dos experimentos foram utilizados camundongos machos C57BL/6J com idade entre 8-10 semanas e com peso entre 25-30 gramas, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas, SP. Os camundongos foram alojados em salas de temperatura de 22± 1°C em ciclo de claro-escuro de 12h, com livre acesso à água e à ração.

Todos os procedimentos com animais e protocolos experimentais estão em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Ética em Pesquisa Animal / Universidade Estadual de Campinas (CEEA-UNICAMP, protocolo 3764-1).

4.1 Grupos experimentais

Foram realizados os seguintes grupos experimentais: I- Camundongos injetados com salina (30 µl, i.p); II- Camundongos injetados com NAC (150 mg/kg, i.p);

III- Camundongos tratados com pravastatina (20mg/Kg, gavagem)

IV- Camundongos injetados com LPS (LPS de Escherichia coli1 mg/kg, i.p.) V- Camundongos tratados com NAC e LPS;

VI- Camundongos tratados com Pravastatina e LPS;

 No grupo I os camundongos receberam injeção de salina e depois de 2h, 6h, 24h e 48h foi realizado o experimento.

 No grupo II, depois de 6h que os camundongos receberam a injeção de NAC foi realizado o experimento.

 No grupo III, os camundongos foram tratados com pravastatina durante 7 dias, e no sétimo dia foi realizado o experimento.

 No grupo IV os camundongos receberam injeção de LPS e depois de 2h, 6h, 24h e 48h foi realizado o experimento.

 No grupo V, os camundongos receberam injeção de LPS, 30 min depois foram tratados com NAC e 6h depois da injeção do LPS foi realizado o experimento.

 No grupo VI, os camundongos foram tratados com pravastatina durante 7 dias. No sétimo dia foi injetado o LPS e depois de 6h foi realizado o experimento.