Le contenu du schéma d’aménagement et de gestion de l’eau

A síndrome da mancha branca (WSS) é a enfermidade mais importante no que se refere às perdas produtivas e econômicas de todos os tempos na carcinicultura mundial. Desde o seu surgimento em 1992, vários estudos vêm sendo conduzidos com o intuito de minimizar o impacto causado por esta virose nos cultivos. A compreensão dos mecanismos de defesa antivirais desencadeados pelos crustáceos se torna cada vez mais imprescindível para um amplo entendimento dos processos envolvidos na interação patógeno/hospedeiro, como também para o desenvolvimento de métodos mais eficazes de prevenção e controle da WSS. Nesse contexto, a utilização da tecnologia do RNAi se destaca como uma das mais efetivas e potenciais terapias antivirais para as viroses de crustáceos de interesse econômico [42,50].

O uso potencial de dsRNA para bloquear especificamente a progressão de infeções virais em peneídeos tem sido utilizado contra, no mínimo, três vírus não relacionados: WSSV [58,60-62], TSV (Taura Syndrome Virus) [58] e YHV (Yellow Head Virus) [66-68]. Nesses estudos, sequências específicas de dsRNA correspondentes à proteínas virais foram utilizadas como agente terapêutico, e uma vez que o animal tenha entrado em contato com o vírus correspondente, uma resposta antiviral específica foi desencadeada levando a uma redução nos índices de mortalidade e a uma importante limitação na replicação viral. No caso do WSSV, a replicação pôde ser eficientemente suprimida por injeções com dsRNA ou siRNA correspondentes aos genes das proteínas virais vp19, vp28, vp281 e proteína quinase [58,60-62].

No presente estudo, foram avaliados os hemogramas e a expressão gênica de algumas proteínas associadas ao sistema imune em L. vannamei induzidos a uma proteção antiviral específica por injeções com dsRNA de sequência homóloga ao gene codificante para a proteína vp28 do envelope do WSSV. Os animais foram primeiramente tratados com dsRNA vp28 e 48h após, desafiados com inóculo puro de WSSV. O tratamento dos camarões com dsRNA vp28 limitou de maneira importante a infecção por WSSV, onde elevadas taxas de sobrevivência (73%) foram registradas após 30 dias da infecção, além de se observar a ausência do vírus em 80% dos animais sobreviventes. Em contrapartida, animais infectados com WSSV, mas não tratados com dsRNA vp28, tiveram uma mortalidade de 100% 5 dias após o desafio. A eficiência da sequência dsRNA vp28 utilizada nesse estudo corrobora os resultados anteriormente encontrados por Méjia-Ruiz et al. [62]. Nesse estudo, uma única dose de dsRNA vp28 (4µg/12g peso vivo) foi suficiente para conferir uma atividade antiviral em L. vannamei por 30 dias, em 50%

dos animais que foram submetidos a infecções reincidentes por WSSV. Além disso, os sobreviventes tratados com dsRNA vp28 não apresentavam mais o vírus no organismo [62].

Sabe-se que o grau de proteção conferido por dsRNA específico varia entre os diferentes genes virais-alvo, indicando que a escolha do gene alvo é um fator limitante no sucesso da supressão da infecção viral [58]. Por exemplo, camarões injetados com dsRNA correspondentes aos genes da vp28 e da proteína quinase (proteína não estrutural do vírus) apresentam uma maior taxa de sobrevivência, do que aqueles injetados com dsRNA da vp281, outra proteína do envelope do WSSV [60].

A vp28 é uma das principais proteínas do envelope do WSSV, sendo responsável pela entrada do vírus nas células do hospedeiro e, necessitando, contudo, ser sintetizada junto ao virion para que o processo de infecção se efetive. Uma vez que a síntese da vp28 for bloqueda via RNAi, a ocorrência dos processos de infecção e replicação virais é limitada ou interrompida, como demonstrado em nosso estudo e por outros precedentes [58,60-62,69]. Kim et al. [60] relataram uma sobrevivência de 100% em P. chinensis infectados com altas doses de WSSV e previamente injetados com dsRNA vp28 (6µg/6g peso vivo). Já, Robalino et al. [58] relataram uma sobrevivência de 85% em L. vannamei injetados com o WSSV e que receberam uma injeção prévia de dsRNA vp28.

Em nosso trabalho, o fato do tratamento com dsRNA vp28 não ter causado uma proteção e uma ausência do vírus em 100% dos animais, deve-se provavelmente ao elevado poder infectante do inóculo viral utilizado, ou ainda referente à dose utilizada de dsRNA (4µg/12g peso vivo). Alguns autores sugerem que o efeito inibitório do dsRNA sob a replicação viral seja dose-dependente. Robalino et al. [58] observaram uma maior sobrevivência (81%) em L. vannamei (1-2g) infectados com o WSSV quando injetados com 10µg de dsRNA vp19, em contrapartida aos 29% de sobrevivência observados em animais injetados com apenas 0,1µg dsRNA vp19. Em outro estudo, avaliando a infecção do YHV em P. monodon [67] foi relatada uma completa proteção dos animais (100% de sobrevivência) somente quando altas doses de dsRNA (25µg/10g de peso vivo) foram injetadas. No entanto, a maioria dos estudos com camarões preconiza que doses entre 1-5 µg de dsRNA específico seja suficiente para limitar a replicação viral e diminuir significativamente a mortalidade dos animais, posteriormente infectados pelo vírus a que corresponde [59].

No presente estudo, contudo, um fato a ser considerado é que todos os animais sobreviventes à infecção por WSSV permaneceram vivos por 30 dias, mesmo que 20% deles ainda apresentavam o vírus em

seu organismo. Esses achados são extremamente relevantes, uma vez que demonstram que o tratamento prévio de L. vannamei com dsRNA vp28, na concentração utilizada, foi capaz de induzir o sistema RNAi, levando ao controle da infecção viral em sua fase inicial, além de promover a ausência do vírus na maioria dos animais. Dessa maneira, a utilização de dsRNA vp28 poderia representar uma potencial terapia antiviral de caráter preventivo contra o WSSV, em camarões desafiados com altas doses virais.

Em relação ao número de hemócitos circulantes foi observada uma redução na contagem de hemócitos totais (CTH) em todos os animais, nas primeiras 6 horas pós-inoculação. Contudo, a CTH nos animais controle e naqueles tratados com dsRNA vp28/desafiados com WSSV houve uma recuperação nos valores a partir de 48 e 72 horas da injeção, diferentemente do grupo apenas desafiado com vírus, que continuou com sua CTH diminuída. Relatos de diminuições na CTH em camarões que sofreram estresse por injeções de qualquer natureza são comuns e podem, em parte, estar associados à infiltração dos hemócitos no local da injúria para auxiliar no reparo dos tecidos lesados pela injeção [40]. Por outro lado, a recuperação na CTH dos animais tratados com dsRNA vp28 e desafiados com vírus sugere que, a ativação do sistema RNAi, além de limitar a progressão viral, propiciou uma recuperação nas condições gerais de saúde dos animais, possibilitando que novas células imunocompetentes fossem produzidas pelo tecido hematopoiético. Em contrapartida, a queda brusca e crescente da CTH nos animais apenas desafiados com WSSV, indica que a depleção dos hemócitos circulantes esteja diretamente associada à replicação viral, uma vez que ocorreu em estágio mais agudo da infecção.

Sabe-se que os hemócitos são um dos principais sítios de replicação do WSSV [70] e diversos trabalhos já demonstraram que há uma diminuição significativa na quantidade de hemócitos em camarões infectados [16,18,38,40,71-74]. Esse declínio na CTH nos animais infectados deve particularmente ter ocorrido devido à lise celular intensa advinda da expressiva replicação viral nos hemócitos. Efetivamente, Sarathi et al. [40] observaram uma queda na CTH de Fenneropenaeus indicus após infecção severa com WSSV associada tanto à lise, quanto à apoptose celulares. Embora os fenômenos de lise e apoptose celulares não terem sido diretamente verificados em nosso estudo, esses fenômenos usuais em infecções virais deve ter também ocorrido em nossos animais infectados. Apesar da apoptose celular não ter sido sugerida nos animais pelos nossos resultados das análises de expressão gênica da caspase-3, que foi modulada negativamente pelo WSSV (dados discutidos adiante), a hipótese de que a diminuição na CTH

ocorreu em parte pela apoptose celular não deve ser completamente descartada. No mínimo duas classes de caspases foram até o momento identificadas em camarões: uma caspase-3 efetora [46-48] e uma caspase 8 ou 10 iniciadora [49]. No entanto, é lógicamente esperado que existam outras classes de capases, a exemplo do que ocorre em outros animais. Essa hipótese é corroborada pelos recentes achados de Chang et al. [75], onde L. vannamei infectados com Vibrio alginolyticus apresentaram hemócitos apoptóticos em período anterior ao aumento da atividade enzimática e expressão da caspase-3, indicando assim que a apoptose estaria sendo ativada por outras caspases efetoras, possivelmente a caspase-7, que em aves participa dos estágios iniciais do processo apoptótico [76]. Por outro lado, a redução significativa na CTH observada em L. vannamei em estágios mais avançados da infecção (72h pós-desafio) pode ainda estar relacionada a uma diminuição na produção dos hemócitos pelos órgãos hematopoiéticos, uma vez que já foi demonstrado em outro crustáceo, no lagostim Pacifastacus leniusculus, que o WSSV infecta as células do tecido hematopoiético, prejudicando seu funcionamento e, consequentemente, a produção de novos hemócitos [77].

Em relação à análise de expressão gênica de proteínas imunológicas nos diferentes grupos de L. vannamei avaliados nesse estudo, observou-se um comportamento bastante diferenciado para cada gene no que se refere ao grau de expressão entre os animais desafiados com WSSV e tratados ou não com dsRNA vp28. Nos animais controle, não injetados nem com dsRNA vp28, nem com o vírus, houve uma alteração nos níveis de expressão de alguns genes (caspase-3, ALF e proPO) nos períodos analisados, estando isso muito provavelmente relacionado à manipulação dos animais e à injeção com inóculo negativo. Alterações na expressão de alguns genes imunológicos, tais como PAMs, já foram relatadas em outros trabalhos onde os camarões foram injetados apenas com solução salina [78,79]. Além disso, convém ressaltar que o inóculo negativo utilizado em nosso estudo continha um pool de proteínas exógenas (de outro animal), e que isso parece ter alterado, ao menos transitoriamente, a expressão de alguns genes imunológicos.

Dentre as proteínas do sistema RNAi, a família das argonautas são as proteínas-chave para o silenciamento gênico pós-transcricional, uma vez que são componentes fundamentais (proteína slicer) do complexo multiproteico de silenciamento induzido (RISC) [54,55,80,81]. Em camarões, duas isoformas da proteína argonauta já foram clonadas em P. monodon, a PmAgo [56] e a PemAgo [57]. Em nosso estudo, a análise da expressão gênica da argonauta em L.

vannamei infectados com WSSV, mas não tratados com dsRNA vp28, aumentou somente nas primeiras 3 horas após o desafio, sugerindo uma estimulação do sistema RNAi restrita ao inicio do processo infeccioso. Sabe-se que infecções virais severas, como a utilizada em nosso estudo, levam a uma rápida replicação e evolução do processo infeccioso o que gera nos animais uma condição de debilidade imunológica generalizada [70]. À medida que a infecção viral progrediu, uma depleção do sistema RNAi parece ter ocorrido nos animais, uma vez que a partir das 6h a expressão da argonauta diminuiu consideravelmente. Em outro estudo com P. monodom infectados com YHV ou com WSSV, a expressão da argonauta foi aumentada apenas nas primeiras 24h pós-infeccão [56], seguido por um declínio rápido na expressão 30h pós-infeccão e sendo praticamente indetectável nos animais moribundos. A expressão da argonauta não foi aqui verificada em animais moribundos, no entanto, a mortalidade total dos animais em 5 dias reforça a hipótese de Unajak et al. [56], de que a diminuição da expressão dessa proteína slicer, em estágios mais avançados da infecção, reflete a ausência da atuação do sistema RNAi inibindo a replicação viral no hospedeiro. Por outro lado, em nosso estudo, em L. vannamei tratados com dsRNA vp28 observou- se uma superexpressão da argonauta (80%) ainda 48h antes do contato dos animais com o vírus, ou seja, na ausência da forma viral infectante, expressão essa se mantendo alta até o final das análises (72h). O fato de estes animais apresentarem uma superexpressão da argonauta ao longo do experimento, aliado aos altos índices de sobrevivência e a ausência do vírus em 80% dos sobreviventes, indicam claramente que houve a ativação do sistema de RNAi nos animais e que este promoveu uma defesa antiviral contra o WSSV.

Outro mecanismo antiviral desencadeado nos crustáceos é a apoptose celular, processo este mediado pelas caspases [44,45]. Vários estudos relatam a indução de apoptose ao longo de infecções virais em camarões [50,51,73,82]. Em nosso estudo, uma progressiva diminuição na expressão da caspase-3 foi encontrada nos camarões desafiados com WSSV (não tratados com dsRNA vp28), chegando a uma depleção quase total na sua expressão, 72h pós-infecção. O desafio de L. vannamei com WSSV promoveu uma rápida evolução do processo infeccioso, debilitando os animais e depletando a expressão dessa caspase efetora. Por outro lado, apesar de a expressão da caspase nos camarões tratados com dsRNA vp28 ter sido, em geral, maior do que nos animais apenas desafiados com WSSV, os níveis de transcritos foram em geral menores do que os dos animais controle, sugerindo que a presença do WSSV modula negativamente a expressão gênica da caspase-3.

Embora a apoptose celular não tenha sido diretamente investigada em nosso estudo, sabe-se que ao longo da evolução os vírus desenvolveram estratégias para evitar ou retardar este processo e garantir assim sua replicação no hospedeiro. Vírus de insetos, como certos baculovírus, podem se beneficiar com a expressão de genes antiapoptóticos [83,84], agindo diretamente na via de sinalização de apoptose ou inibindo a atividade de caspases [85]. No caso do WSSV, um gene codificante para uma nova classe de proteína antiapoptótica, denominada WSSV449 (ou ORF 390), já foi identificada em seu genoma [86], sendo que a sua forma recombinante é capaz de inibir in vitro uma caspase efetora de P. monodon [87].

Além disso, outro fato a ser considerado é de que os animais severamente infectados estavam imunodeprimidos e impedidos assim de acionar mecanismos antivirais para conter a infecção brutal, que levou a morte 100% dos animais em 5 dias. Curiosamente, há relatos na literatura que descrevem a indução da caspase-3 em P. merguiensis moribundos infectados pelo WSSV [46] e em P. monodon apenas 48h após a infecção pelo mesmo vírus [47]. Cabe, contudo salientar que os estudos mencionados acima foram com outras espécies de peneídeos e com cepas virais diferentes, além de as análises serem pontuais durante a infecção, não permitindo dessa forma estabelecer comparações diretas com nossos resultados. Além disso, como mencionado anteriormente, os mecanismos de regulação das vias apoptóticas em crustáceos, dos indutores e inibidores, não são ainda completamente conhecidos [44]. Consequentemente, as divergências encontradas entre os trabalhos revelam que maiores estudos devem ser coduzidos para elucidar o papel antiviral da apoptose contra infecções pelo WSSV em crustáceos, bem como sobre a atuação de proteínas virais antiapoptóticas beneficiando o processo infeccioso.

Outra proteína recentemente descrita em crustáceos estando envolvida na limitação de infecções por WSSV é o peptídeo antimicrobiano ALF [33,34]. No presente estudo, uma depleção na expressão gênica desse PAM foi encontrada nos animais apenas desafiados com WSSV, ao longo de todo o experimento, indicando uma modulação negativa desse gene associada à progressão da replicação por WSSV em L. vannamei. Por outro lado, a superexpressão do ALF encontrada nos camarões tratados com dsRNA vp28, nas 3 e 24h após o desafio com WSSV, sugere que esse PAM deva atuar na fase inicial do processo infeccioso, embora o seu papel antiviral não tenha sido aqui investigado. Interessantemente, parece que a expressão do ALF não é modulada em L. vannamei (1,5g) submetidos a infecções brandas por WSSV [88]. Já, no lagostim P. leniusculus uma superexpressão do ALF

foi registrada nos animais severamente infectados por WSSV [33]. Diferenças entre os nossos resultados e aqueles obtidos por Liu et al. [33] podem ser em parte devido ao fato de que os crustáceos sejam um grupo taxonômico diverso, cujas respostas às infecções podem ser bastante diversificadas, especialmente considerando-se animais de diferentes habitats, como é o caso de peneídeos e lagostinsde água doce. Devemos, contudo considerar que existem diferentes isoformas de ALF, cuja expressão também pode ser diferenciada, além de existir diferentes cepas de WSSV, com graus diferenciados de virulência.

Se por um lado o papel antiviral do ALF não tenha ainda sido comprovado, por outro, vários estudos indicam que esse PAM tenha um efeito inibitório sobre a infecção por diferentes vírus, tais como o WSSV [34], adenovirus e o vírus da herpes [89]. Liu et al. [34] demonstraram que o silenciamento gênico pós-transcricional do ALF leva a um aumento na taxa de replicação do WSSV em P. leniusculus, sugerindo que esse PAM possua um papel antiviral nos crustáceos. Mais recentemente, Tharntada et al. [34] demonstraram que uma forma recombinante de ALF era capaz de inibir in vitro a replicação do WSSV, em cultura de células hematopoiéticas de P. leniusculus. Nesse mesmo estudo, ficou ainda demonstrado que camarões P. monodon previamente injetados com o ALF recombinante tinham a infecção por WSSV limitada e sua sobrevivência aumentada. Embora não haja, ao nosso conhecimento, relatos sobre a expressão do ALF em crustáceos previamente induzidos ao sistema RNAi e desafiados posteriormente com vírus, nossos resultados demonstram que o tratamento com dsRNA vp28 levou ao restabelecimento das condições de saúde dos camarões, limitando a replicação viral através da atuação do sistema RNAi, e permitindo que PAMs importantes, como o ALF, continuassem sendo expressos. Em contrapartida, animais desafiados com altas doses de WSSV e não tratados com dsRNA vp28 tiveram a expressão do ALF depletada, inviabilizando assim uma potencial atividade antiviral desse PAM contra o WSSV.

A expressão da proteína que reconhece tanto LPS quanto β-1,3- glicanas (LGBP) também foi investigada neste estudo. De maneira muito interessante, a depleção dos transcritos da LGBP nas 3h após o desafio viral dos animais (não tratados com dsRNA vp28) foi semelhante àquela dos animais tratados com dsRNAvp28 após 6h, ainda antes do desafio com WSSV. Poder-se-ia então especular que, algo na sequência ou no tamanho do dsRNA vp28 promova a inibição da expressão gênica da LGBP nessa fase inicial, uma vez que essa sequência de oligonucleotideo é virtualmente encontrada também nos animais que foram infectados com WSSV. Os mecanismos que levam a

essa depleção gênica são ainda desconhecidos, porém poderiam estar relacionados à sequência e ao tamanho do oligonucleotídeo dsRNA vp28 e merecem ser melhor investigados no futuro. Por outro lado, os altos níveis de expressão da LGBP nos animais apenas infectados pelo WSSV, 6h após o desafio indicam que a LGBP seja uma proteína induzível de fase aguda da infecção por WSSV. Esta hipótese foi reforçada pela análise de expressão com os camarões tratados com dsRNA vp28 que foi muito semelhante àquela do grupo controle. Assim como em nosso estudo, um aumento acentuado na expressão da LGBP foi relatado em L. stylirostris [16,17], e L. vannamei [18] na fase aguda de uma infecção por WSSV.

Estes resultados conjuntos sugerem um possível envolvimento da LGBP em infecções virais e não somente em infecções bacterianas e fúngicas, como comumente preconizado para essa PRP. Yeh et al. [90] hipotetizaram que esta PRP poderia reconhecer componentes virais, e por isso sua expressão aumentaria mediante a fase aguda de uma infecção viral. Estes autores observaram que 12h após a injeção de Macrobrachium rosembergii com o oligonucleotídeo sintético poly I:C, que mimetiza um dsRNA viral e ativa o sistema interferon em mamíferos [91], houve um aumento da expressão da LGBP no hepatopâncreas dos animais. O fato de a LGBP ter sido superexpressa em L. vannamei severamente infectados por WSSV, não credencia uma hipótese definitiva de que essa PRP tenha um papel antiviral, considerando que se assim fosse os animais não teriam morrido em 5 dias. Ao contrário, poderíamos hipotetizar que sendo as LGBPs proteínas clássicas de reconhecimento-padrão, produzidas tanto pelos hemócitos [13-15] quanto pelo hepatopâncreas dos crustáceos [14,16], essa PRP poderia estar reconhecendo algum componente viral e facilitando de algum modo a infecção e/ou replicação do WSSV no hospedeiro, e por isso uma superexpressão seria observada na fase aguda da infecção. No entanto, essas hipóteses antagônicas de um papel pró ou antiviral para a LGBP necessitam ser investigadas, para melhor compreender essa questão.

Outra análise feita em nosso estudo foi avaliar a expressão gênica do inibidor de proteases α2-macroglobulina (α2M). Essa glicoproteína plasmática inibe tanto proteases endógenas, como as serino-proteases ativadoras do sistema proPO [24,92], quanto exógenas produzidas pelo patógeno, como os vírus, e que potencializam o processo infeccioso [93]. A expressão da α2M em L. vannamei infectados severamente com