6.7 Le cas rugueux d’ordre 3
6.7.1 Construction de l’intégrale
Foi pesado 1,0 g de células liofilizadas e adicionaram-se 10 mL de água destilada a 40-42 ºC em um Erlenmeyer de 25 mL. O substrato (0,05 mmol) foi diluído em 7% v/v de DMSO e a solução foi adicionada à suspensão celular. A reação foi mantida a 30 ºC, 180 rpm de agitação e monitorada por CG-EM tomando alíquotas de 300 L e extraindo com 1 mL de acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre Na2SO4 e 700 L desta fase foram adicionados a um vial e levado ao rota para remover o solvente sob pressão reduzida.
Adicionalmente, para o substrato 94 foi utilizada a resina Amberlite XAD7HP da Sigma Aldrich para adsorver o substrato. Neste caso, 0,5 mmol de substrato foi dissolvido em 1 mL de éter etílico e adicionado a 350 mg de resina, após secar o solvente, a resina foi adicionada à suspensão celular. Alternativamente, o substrato (0,05 mmol) foi adsorvido em papel de filtro (aproximadamente 2 cm2 por mg de substrato) e adicionado em pequenos pedaços à suspensão celular.
6.4.7. Biocatálise procedimento geral para as biorreduções usando as EREDs do kit de screening da Codexis
Para cada substrato testado pesou-se uma quantidade equivalente a 0,5 mmol e foi dissolvida em 1 mL de DMSO. Uma segunda solução (solução de cofator) foi
preparada com 20 mg GDH-105, 2 molar equivalentes de glicose (relativo ao substrato), 5 mg NADP+ em 9 mL de tampão fosfato de sódio pH 7. A solução 1 foi adicionada à solução dois e misturaram-se.
Após a mistura das soluções 1 e 2, aproximadamente 1 mg de cada ERED do kit (7 em total) foram pesados em eppendorf separados de 2 mL de volume e para iniciar a reação de biocatálise, 1 mL das solução de substrato/cofator foi adicionada a cada eppendorf. Os tubos foram agitados a 180 rpm e 30 °C e após 1 h tomou-se uma alíquota de 200 uL. Esta alíquota foi extraída com 1 x 500 uL de acetato de etila e injetada no CG-EM. Após 24 h tomou-se uma segunda alíquota e analisou-se com o mesmo procedimento descrito.
6.5. Reagentes químicos
Todos os reagentes utilizados foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Os solventes utilizados foram grau PA e adicionalmente foram devidamente tratados antes de se realizar as reações. Os seguintes solventes e reagentes receberam tratamento prévio:
- THF e dietil éter foram mantidos sob refluxo na presença de sódio metálico e destilado imediatamente antes do uso.
-Tolueno foi seco com peneira molecular 4 Å da Sigma Aldrich e CaH2 por 3 dias. -CH2Cl2 foi seco com peneira molecular 4 Å da Sigma Aldrich.
6.5.1. Síntese das enonas 69, 71-73
As enonas 71-73 foram preparadas a partir da enona 77, mediante substituição nucleofílica do Br pelos respectivos nucleófilos em acetona durante 3 h de reação. A enona 77 foi preparada partindo do aduto de Baylis-Hillman 76, como descrito a continuação e seguindo a metodologia de de Paula et al.[84,85]
6.5.1.1. Síntese do 3-(hidroxi(fenil)metil)-3-buten-2-ona (76)
3-buten-2-ona (1,82 g, 26 mmol), benzaldeído (2,120 g, 20 mmol) e DABCO (0,448 g, 4 mmol) foram adicionados a um balão de fundo redondo de 25 mL e manteve em agitação à temperatura ambiente. A reação foi monitorada por CCD e
após 5 h, foi adicionado 10% HCl (10 mL) ao balão. Seguidamente, a mistura foi extraída com acetato de etila (3 x 25 mL). As fases orgânicas foram juntadas e lavadas com 10% HCl, 10% NaHCO3 e solução saturada de cloreto de sódio e secadas com Na2SO4. O solvente foi removido sob pressão reduzida.
Óleo incolor que não precisou de purificação, o rendimento foi de 79%. Tempo de retenção CG-EM: 7,83 min; EM m/z (%): 176 (23) [M+], 175 (100), 161 (14), 158 (24), 131 (13), 116 (15), 115 (53), 105 (42), 79 (29), 78 (10), 77 (54), 55 (13), 51 (18); RMN de 1H (CDCl3, 400 MHz): δ = 2,27 (s, 3H), 3,47 (s, 1H), 5,57 (s, 1H), 5,98 (s, 1H), 6,15 (s, 1H), 7,29 (m, 5H). RMN de 13C (CDCl3, 101 MHz): 26,3, 72,3, 126,3, 126,4, 127,5, 128,2, 141,5, 149,9, 200,1. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.1.2. Síntese do (Z)-3-bromometil-4-fenil-3-buten-2-ona (77)
Em um balão de 10 mL, foram adicionados o produto anterior (352 mg, 2 mmol) e 48% HBr (4 mL) com agitação vigorosa. A mistura foi mantida sob agitação por 1 min e posteriormente, foi adicionada água destilada (50 mL), usando acetato de etila para dissolver qualquer sólido formado durante a adição do HBr. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (3 x 50 mL). As fases orgânicas foram juntadas e lavadas com 10% NaHCO3, solução saturada de cloreto de sódio e seca com Na2SO4. O solvente foi removido sob pressão reduzida e a mistura foi purificada por cromatografia em coluna, usando hexano/acetato de sódio.
O produto obtido foi um sólido branco cristalino rendimento 84%. Ponto de fusão: 45,2-46,8 °C; Tempo de retenção CG-EM: 7,56 min; EM m/z (%): 159 (61), 158 (15), 116 (35), 115 (75), 89 (13), 43 (100); RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz): δ = 2,51 (s, 3H), 4,36 (s, 2H), 7,41- 7,50 (m, 5H). RMN de 13C (CDCl3, 126 MHz): 25,1, 25,9, 128,6, 128,9, 129,6, 134,2, 137,3, 142,8, 197,2. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.1.3. Síntese do (Z)-3-azidometil-4-fenil-3-buten-2-ona (71)
Em um balão de 5 mL contendo acetona (1 mL) foram adicionados (Z)-3- bromometil-4-fenil-3-buten-2-one (238 mg, 1 mmol) e NaN3 (65 mg, 1 mmol). A mistura foi mantida sob agitação por 3 h, filtrada e o solvente removido sob pressão reduzida e o produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila.
A enona foi obtida como um óleo marrom e rendimento 72% (1.71 g). Tempo de retenção CG-EM: 7,52 min; EM m/z (%): 201 (1) [M+], 173 (7), 172 (31), 131 (11), 130 (33), 129 (6), 115 (14), 104 (11), 103 (23), 77 (18), 44 (100); RMN de 1H NMR (CDCl3,
500 MHz) δ = 2,52 (s, 3H), 4,16 (s, 2H), 7,45 (m, 5H), 7,78 (s, 1H). RMN de 13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ = 25,4, 45,3, 128,8 (2), 129,8, 134,0, 135,6, 144,7, 198,8. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.1.4. Síntese do (Z)-4-fenil-3-tiocianatoximetil-3-buten-2-ona (72) Em um balão de 5 mL contendo acetona ( 1 mL) foram adicionados (Z)-3- bromometil-4-fenil-3-buten-2-one 77 (238 mg, 1 mmol) e KSCN (97,2 mg, 1 mmol). A mistura foi mantida sob agitação por 2 h, filtrada e o solvente removido sob pressão reduzida e o produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila.
O produto obtido foi um líquido incolor, com 80% de rendimento. Tempo de retenção CG-EM: 6,71 min; EM m/z (%): 218 (4) [M+], 217 (23), 216 (26), 191 (12), 190 (89), 176 (9), 160 (6), 159 (8), 147 (33), 129 (13), 128 (34), 118 (16), 117 (87), 116 (16), 115 (38), 91 (85), 77 (11), 65 (25); RMN de 1H (CDCl3 , 500 MHz) δ = 2,55 (s, 3H), 4,08 (s, 2H), 7,50 (q, J=6.6, 5H), 7,86 (s, 1H). RMN de 13C (CDCl3, 126 MHz) δ = 25,4, 29,6, 112,4, 129,1, 130,0, 133,6, 135,2, 144,8, 197,7. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.1.5. Síntese do (Z)-4-fenil-3-fenoximetil-3-buten-2-ona (73)
Em um balão de 5 mL contendo acetona (1 mL) foram adicionados (Z)-3- bromometil-4-fenil-3-buten-2-one 77 (238 mg, 1 mmol), fenol (94 mg, 1 mmol) e K2CO3 (152 mg, 1,1 mmol). A mistura foi mantida sob agitação por 4 h, filtrada e o solvente removido sob pressão reduzida e o produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila.
O produto obtido foi um óleo incolor com rendimento de 50%. Tempo de retenção CG-EM: 9,00 min. EM m/z (%): 252 (2) [M+], 159 (49), 116 (9), 115 (29), 115 (69), 94 (15), 65 (10), 43 (100); RMN de 1H (CDCl3, 400 MHz) δ = 2,51 (s, 3H), 4,83 (s, 2H), 7,43 – 6,97 (m, 10H), 7,85 (s, 1H). RMN de 13C (CDCl3, 101 MHz,) δ = 26,2, 61,6, 114,9, 121,1, 128,7, 129,4, 129,7, 129,7, 134,4, 135,8, 145,0, 158,4, 198,5. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.1.6. Síntese do (Z)-3-acetóximetil-4-fenil-3-buten-2-ona (69)
Em um balão de 5 mL foram adicionados ácido trifluoracético (1 mL, 13 mmol) e K2CO3 (1,52 g, 11 mmol), (Z)-3-bromometil-4-fenil-3-buten-2-ona 77 (2,38 g, 10 mmol) e acetona (10 mL) e a mistura foi mantida em refluxo por 6 h. Após este tempo, a mistura foi resfriada à temperatura ambiente e foi adicionada água (100 mL). O produto foi extraído com acetato de etila e a fração orgânica lavada com salmoura e secada com Na2SO4. O solvente removido sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi dissolvido em diclorometano (50 mL) e a solução resultante foi resfriada a 0 ºC e em seguida foi adicionado anidrido acético (1,135 mL, 12 mmol), trietilamina (1,67 mL, 12 mmol) and DMAP (122 mg, 1 mmol). A mistura foi agitada por 1 h e logo foi adicionada água (100 mL) e mantida 15 min mais em agitação. A fração orgânica foi separada e a fração aquosa foi extraída com diclorometano. As frações orgânicas foram lavadas com salmoura de cloreto de sódio e secadas com Na2SO4. O solvente removido sob pressão reduzida e o produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila.
A enona foi obtida como um óleo incolor e rendimento 72% (1.71 g). Tempo de retenção CG-EM: 7.65 min; EM m/z (%): 218 (12) [M+], 176 (14), 175 (31), 159 (8), 158 (44), 157 (9), 143 (8), 133 (16), 130 (6), 129 (11), 117 (10), 116 (14), 115 (53),103 (7), 77 (4); RMN de 1H (CDCl3, 400 MHz) δ = 2,08 (s, 3H), 2,49 (s, 3H), 4,94 (s, 2H), 7,41 (m, 5H), 7,79 (s, 1H). RMN de 13C NMR (CDCl3, 101 MHz,) δ = 20,9, 26,0, 58,4, 128,7, 129,4, 129,7, 134,2, 135,3, 144,9, 170,6, 198,2. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.2. Preparação dos padrões dos produtos de redução 36, 68, 74 e 75
6.5.2.1. Síntese da 4-fenil-3-metilideno-2-butanona (68)
A um balão de 25 mL foram adicionados 4-fenil-2-butanona (2,96 g, 20 mmol) e ácido acético glacial (10 mL), solução aquosa formaldeído 37% (2 mL) e morfolina (86 L, 1 mmol). A mistura foi refluxada por 24 horas e após este tempo, a mistura foi resfriada e neutralizada com NaOH 10%. O produto foi extraído com acetato de etila e fase orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre Na2SO4 e o solvente removido sob pressão reduzida. O produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila.
A enona foi obtida como um óleo incolor e rendimento 10% (160 mg). Tempo de retenção CG-EM: 5,87 min; EM m/z (%): 160 (41) [M+], 159 (48), 145 (41), 117 (69), 116 (71), 115 (100), 91 (47), 89 (11), 65 (16), 63 (11), 51; RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) δ = 2,34 (s, 3H),3,59 (s, 2H), 5,64 (s, 1H), 6,09 (s, 1H), 7,23 (m, 5H). RMN de 13C (CDCl3, 126 MHz) δ = 26,0, 36,7, 126,2, 126,4, 129,1, 139,1, 148,7, 199,2. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.2.2. Síntese da 4-fenil-3-metil-2-butanona (36)
A cetona 36 foi obtida mediante a hidrogenação de 50 mg do composto 68 com 5 mg de Pd/carvão em acetato de etila sob 20 bar de H2 por 4 horas. Após o término
da reação, a mistura reacional foi filtrada, o solvente removido sob pressão reduzida e o produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila. A purificação não foi bem sucedida mas conseguiram ser identificadas os picos correspondentes ao compostos no espectro de RMN 1H e no CG-EM.
O composto foi obtido como um óleo incolor e rendimento 45% (22,5 mg). Tempo de retenção CG-EM: 5,72 min; tempo de retenção no CG-DIC: (R)-36 20,31 min e (S)-36 20,69 min. EM m/z (%):162 (32) [M+], 147 (25), 119 (14), 117 (10), 91 (100). Alguns dos dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.2.3. Síntese da 3-azidometil-4-fenil-2-butanona (74)
A hidrogenação de 71 para obter o padrão de 74 não teve o resultado esperado e apenas 36 foi isolado após 24 de reação com Pd/carvão em acetato de etila sob 20 bar de H2. Uma segunda metodologia tentando a redução com o composto éster de Hantzsch também não levou à formação de 74. Neste caso, foi utilizada uma amostra padrão impura doada pelo Dr. Bruno de Paula para realizar a caracterização via CG-EM e CG-DIC do produto obtido nas biocatálises realizadas nesta tese.
Tempo de retenção CG-EM: 7,07 min; tempo de retenção no CG-DIC (Método A): (S)-74 36,52 min e (R)-74 36,80 min. EM m/z (%): 175 (10), 174 (4), 160 (21), 159 (13),148 (29), 133 (19), 132 (71), 117 (54), 116 (29), 115 (46), 105 (48), 91 (87), 43 (100). Estes dados estão de acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.2.4. Síntese da 4-fenil-3-fenóximetil-2-butanona (75)
A cetona 75 foi obtida mediante a hidrogenação de 63 mg (0,25 mol) do composto 73 com 5 mg de Pd/carvão em acetato de etila sob 20 bar de H2 por 24 horas. Após o término da reação, a mistura reacional foi filtrada, o solvente removido sob pressão reduzida e o produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila.
O composto foi obtida como um óleo incolor e rendimento 70% (46 mg). Tempo de retenção CG-EM: 8,29 min; tempo de retenção no CG-DIC (Método B) (+)-75 92,29 min e (-)-75 92,78 min. EM m/z (%): 161 (7), 160 (5), 119 (10), 118 (110), 117 (45), 94 (69), 91 (22), 65 (12). RMN de 1H (CDCl3, 400 MHz) δ = 2,14 (s, 3H), 2,86 (dd, 1H, J = 7,80, 13,80 Hz), 3,01 (dd, 1H, J = 7,80, 13,80 Hz), 3,25 (dq, 1H, J = 9,60, 13,80 Hz), 4,03 (dd, 1H, J = 4,80, 9,60 Hz), 4,11 (dd, 1H, J = 4,80, 13,80 Hz), 6,84-7,29 (m, 10H). RMN de 13C (CDCl3, 126 MHz,) δ = 30,9, 34,4, 53,8, 67,8, 114,5,121,1, 126,6, 128,6, 128,9, 129,5, 138,6, 158,4, 209,9. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[84,85]
6.5.3. Síntese dos substratos 94-97
6.5.3.1. Síntese do substrato (E)-2-nitro-3-fenilprop-2-en-1-ol (94)
Foi adicionado benzaldeído (106 mg, 1 mmol), nitrometano (336 mg, 6 mmol), piperidina (8,5 mg, 0,1 mmol) a um balão de fundo redondo de 10 mL usando tolueno como solvente (1 mL). Em seguida, foi adicionado cloreto de ferro (III) (16,2 mg, 0,1 mmol). A mistura foi aquecida até refluxo e deixada por 3 h, protegida da umidade. A reação foi monitorada através de alíquotas injetadas CG-EM. Após transcorridas as 3 h, a reação foi resfriada à temperatura ambiente e o solvente removido sob pressão reduzida. O resíduo marrom resultante foi passado por coluna de sílica com 100% de acetato de etila para remover os resíduos de cloreto de ferro (III) e posteriormente o produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila. [112]
O produto foi um sólido cristalino amarelo e o rendimento da reação foi 65% (96 mg). Ponto de fusão 54,5-56,1 °C.EM m/z (%): 149 (60) [M+], 102 (72), 91(58), 77 (100), 51(39). Tempo de retenção CG-EM: 6,25 min; RMN de 1H (CDCl3, 400 MHz) δ = 7,44 (d, J=6,8, 2H), 7,51 (m, 4H), 7,56 (d, J = 5,8, 2H), 7,60 (s, 1H), 7,99 (d, J =13,7, 2H). RMN de 13C (CDCl3,101 MHz) δ = 129,1, 129,3, 129,9, 132,1, 137,0, 139,0. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[112]
A uma solução do (E)-(2-nitrovinil) benzeno 99 formado na etapa anterior (447 mg, 3 mmol em 2 mL THF) e em agitação à temperatura ambiente, foram adicionados imidazol (1 equiv) e ácido antranílico (10 mol%). Seguidamente, foi adicionado formaldeído (1 mL) à solução anterior e a solução resultante foi agitada por 24 horas à temperatura ambiente. Ao completar o tempo necessário, a solução foi acidificada com HCL 5N (2,5 mL) e a fração aquosa foi extraída com acetato de etila e as frações orgânicas foram combinadas e lavadas com salmoura e depois, secadas com Na2SO4 e solvente removido sob pressão reduzida. O produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila. [125]
O produto foi um óleo amarelo claro e o rendimento foi de 48% (264 mg). EM m/z (%): 179 [M+], 131(59), 115 (53), 103 (100), 91(45), 77 (97). Tempo de retenção CG-EM: 7,20 min; RMN de 1H (CDCl3, 400 MHz): δ = 2,99 (s, 1H), 4,70 (s, 2H), 7,51 (m, 5H), 8,20 (s, 1H). RMN de 13C (CDCl3, 101 MHz): 56,5, 129,0, 130,1, 130,9, 131,2, 137,6, 149,3. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura. [125]
6.5.3.2. Síntese do substrato (E)-3-acetoxi-1-fenil-2-nitropropeno (95) A uma solução de (E)-2-nitro-3-fenilprop-2-en-1-ol (150 mg, 0,68 mmol em 4mL de diclorometano) foi adicionado piridina (0,08 mL, 1 mmol) e cloreto de acetila (175 uL, 1 mmol) à 0 ºC. A reação foi acompanhada por CCD até sua finalização, no total foi deixada por 2 h a 0 ºC e em atmosfera inerte. A reação foi diluída com CH2Cl2 (10 mL) e lavada duas vezes com água (5 mL). A fração orgânica foi secada com Na2SO4, filtrada e o solvente removido à pressão reduzida. O produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila.
O produto foi um sólido amarelo e o rendimento foi de 53% (80 mg). Ponto de fusão: 68,0-69,2 ºC. Tempo de retenção CG-EM: 7,79 min. EM m/z (%): 133 (100), 116 (15), 115 (36), 105 (13), 43 (40). RMN de 1H (CDCl3, 400 MHz) δ = 2,15 (s, 3H), 5,22 (s, 2H), 7,49 (m, 5H), 8,36 (s, 1H). RMN de 13C (CDCl3,101 MHz) δ = 20,7, 57,8, 129.26, 130,0, 130,9, 131,3, 145,3, 139,9, 170,3. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[118]
6.5.3.3. Síntese do substrato 3-cloro-1-fenil-2-nitropropeno (96)
Em um balão de 25 mL foi adicionado (E)-2-nitro-3-fenilprop-2-en-1-ol 94 (360 g, 2 mmol) em 10 mL de CH2Cl2. Imediatamente, foi adicionado FeCl3 anidro (480 mg, 3 mmol). Após 5 h em agitação à temperatura ambiente, foi adicionada água (10 mL) e a fração aquosa foi extraída com acetato de etila. As frações orgânicas foram combinadas e lavadas com solução saturada de cloreto de sódio. A fração orgânica foi seca com Na2SO4 e concentrada no rotavaporador. O produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna com hexano/acetato de etila.
O produto obtido foi um sólido amarelo pálido e o rendimento da reação foi 60% (236 mg). O ponto de fusão 118,2-119,6 °C; Tempo de retenção CG- EM: 7,48 min. EM m/z (%): 197 (M+, 15), 131 (10), 116 (26), 115 (100), 103 (15), 89 (11). RMN de 1H (CDCl3, 600 MHz) δ = 4,74 (s, 2H), 7,47 (m, 5H), 8,28 (s, 1H). RMN de 13C (CDCl3,126 MHz) δ = 37,1, 129,4, 130,2, 131,0, 131,4, 138,3, 146,5. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[126]
6.5.3.4. Síntese do substrato 1,3-dihidro-4-nitro-2-benzoxepina (97) Em um balão de 25 mL foi adicionado (E)-2-nitro-3-fenilprop-2-en-1-ol 94 (360 g, 2mmol) e paraformaldeído (200 mg) em 10 mL de CH2Cl2. Após 40 min em agitação, foi adicionado FeCl3 anidro (480 mg, 3 mmol) e deixado em agitação à temperatura ambiente por 30 min. Imediatamente, foi adicionada água (10 mL) e a fração aquosa foi extraída com acetato de etila. As frações orgânicas foram combinadas e lavadas com solução saturada de cloreto de sódio. A fração orgânica foi seca com Na2SO4 e concentrada no rotavaporador e o sólido resultante foi purificado usando acetato de
etila/ hexano.
O produto obtido foi um sólido cristalino amarelo. Ponto de fusão: 90,0-92,0 °C. EM m/z (%): 191 (M+, 15), 131 (10), 116 (26), 115 (100), 103 (15), 89 (11). Tempo de retenção CG-EM: 8,07 min. RMN DEPT 90 13C (CDCl3, 101 MHz) δ = 127,9, 131,2, 134,5, 134,9. RMN DEPT 135 13C (CDCl3, 101 MHz) δ = 71,3, 74,2, 127,9, 128,7, 131,2, 134,5. RMN de 1H
(CDCl3, 400 MHz) δ = 4,75 (s, 2H), 5,04 (s, 2H), 7,3-,74 (m, 4H), 8,17 (s, 1H). RMN de 13C (CDCl3, 101 MHz) δ = 71,3, 74,2, 127,8, 128,6, 129,2, 131,2, 134,5, 134,8, 141,6, 148,8. A estrutura deste composto foi determinada mediante análise de difração de Raio X usando uma mistura de acetato de etila/ hexano 8:92 e seguindo as condições detalhadas na Tabela 13. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto não foram encontrados na literatura consultada.
Tabela 13. Condições usadas na determinação da estrutura de 97 por difração de Raio-X.
Equipamento BRUKER APEX CCD DETECTOR
DIFFRACTOMETER Programa de coleta de dados APEX2 (BRUKER, 2010)
Fonte de radiação FINE-FOCUS SEALED TUBE, Mo Kα (λ = 0.71073 Å)
Resolução do detector 8.3333 PIXELS MM-1
Método de medida PHI AND OMEGA SCANS
Largura da imagem 0,50º
Tempo de exposição por
imagem 30,00 S
Temperatura 150 K
Integração (data reduction)
NARROW-FRAME ALGORITHM, USING A MONOCLINIC UNIT CELL YIELDED A TOTAL OF 15530 REFLECTIONS TO A MAXIMUM θ ANGLE OF 28.35° (0.75 Å RESOLUTION) (SAINT (BRUKER, 2010)
Refinamento da cela
FINAL CELL CONSTANTS OF a = 8.920(8) Å, b = 6.202(4) Å, c = 15.791(12) Å, β = 98.43(4)°, VOLUME = 864.1(19) Å3, ARE BASED UPON THE REFINEMENT OF THE XYZ-CENTROIDS OF 114 REFLECTIONS ABOVE 20 Σ(I) WITH 7.113° < 2θ < 42.76° (SAINT (BRUKER, 2010) Correção de absorção MÉTODO MULTI-SCAN (SADABS (BRUKER,
2010)*)
Tempo de uso do equipamento 22 HORAS
Estrutura resultante SOLUÇÃO FORNECIDA PELO PROGRAMA
6.5.4. Caracterização de (E)-1-fenil-2-nitro-2-propeno (81) e 1-(4- metoxifenil)-2-nitropropeno (98)
Os dois produtos foram doados pelo Doutor Bruno de Paula.
O produto é um sólido laranja. Ponto de fusão 61,8-62,4 °C; EM m/z (%): 163 (M+, 15), 116 (32), 115 (100), 105 (31), 91 (35). Tempo de retenção CG-EM: 6,62 min. RMN de 1H (CDCl3, 600 MHz) δ = 2,46 (s, 3H), 7,42-7,76 (m, 5H), 8,09 (s, 1H). RMN de 13C (CDCl3, 126 MHz) δ = 14,0, 128,9, 129,9 (2), 132,4, 133,5, 147,8. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[127]
O produto é um sólido laranja. Ponto de fusão 44,5-44,8 °C; EM m/z (%): 193 (M+, 15), 116 (32), 115 (100), 105 (31), 91 (35). Tempo de retenção CG-EM: 7,93 min. RMN de 1H (CDCl3, 600 MHz) δ = 2,48 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 6,98 (d, J = 8,7, 2H), 7,43 (d, J = 8,7, 2H), 8,07 (s, 1H). RMN de 13C (CDCl3,126 MHz) δ = 14,1, 55,4, 114,5, 124,7, 132,1, 133,6, 145,7, 161,1. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão em acordo com os dados descritos na literatura.[128]
6.5.5. Síntese dos padrões reduzidos (E)-1-fenil-2-nitro-2-propano (82) e 1-(4-metoxifenil)-2-nitropropano (107), (E)-2-nitro-3- fenil-1-propanol (102) e 4-nitro-1,3,4,5-tetrahydro-2- benzoxepina (106)
A redução dos 4 alcenos foi realizada seguindo a metodologia de Fuji.[129] Em um balão de duas bocas 25 mL com agitador magnético e condensador de refluxo, foi adicionado o alceno correspondente 81, 98, 94 ou 97, (2 mmol), o Éster de Hantzsch (560 mg, 2,2 mmol), sílica (2 g) e 10 mL de tolueno seco. A solução foi mantida em refluxo por 40 min com atmosfera de argônio. A solução foi resfriada até temperatura ambiente, filtrada e lavada com tolueno. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. Os produtos obtidos foram purificados por cromatografia em coluna com
hexano/acetato de etila, porém não foram obtidos com um alto percentagem de pureza. Em todos os produtos ainda foram observadas traças do Éster de Hantzsch.
O produto é um líquido laranja. EM m/z (%): 165 (M+, 2), 119 (12), 118 (67), 91 (100), 65 (8). Tempo de retenção CG-EM: 6,09 min. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão de acordo com os dados descritos na literatura.[104]
O produto é um líquido laranja claro. EM m/z (%): 195 (M+), 149 (33), 148 (79), 121 (100), 91 (23), 77 (14).Tempo de retenção CG-EM: 7,24 min. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão de acordo com os dados descritos na literatura.[104]
O produto obtido foi um amarelo pálido. Ponto de fusão: não determinado. EM m/z (%): 193 (M+, 2), 146 (25), 131 (25), 117 (100), 105 (48), 91 (36). Tempo de retenção CG-EM: 7,69 min. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto não foram encontrados na literatura consultada.
O produto obtido líquido amarelo. EM m/z (%): 134 (39), 117 (12), 105 (26), 91 (100), 77 (15). Tempo de retenção CG-EM: 6,97 min. Os dados espectroscópicos obtidos para este composto estão de acordo com os dados descritos na literatura.[106]
6.6. Métodos docagem molecular
A estrutura tridimensional do ligante foi gerada utilizando-se a versão online do software Corina (https://www.mn-am.com/online_ demos/corina_demo), o qual atribui à estruturas 3-D valores pré-definidos de comprimento e ângulos de ligação com base no tipo de ligação, de átomo e estado de hibridização.[130] As simulações de docagem molecular foram realizadas usando a estrutura 3-D da ERED OYE1 de
S. pastorianus cocristalizada ao ligante 4-Hidroxibenzaldeído (Código de
identificação no Protein Data Bank 1OYB). A estrutura foi checada com relação à ausência de átomos e de cadeias laterais nos resíduos de aminoácidos utilizando-se
o servidor PDB_HYDRO (http://lorentz.immstr.pasteur.fr/pdb/frozen_submission.php) mas nenhuma ausência foi detectada. A estrutura foi então refinada utilizando-se o servidor GalaxyWEB[131] e carregada no software GOLD 5.6 para a realização das simulações de docagem molecular.[101] As simulações foram realizadas dentro de uma esfera com 15 Å de raio, para a qual o centro foi determinado a partir ligante cristalográfico, 4-Hidroxibenzaldeído, sendo as moléculas de água consideradas nas simulações.
GOLD utiliza algoritmos de amostragem genética, inspirados na teoria da evolução de Darwin[132] e 200 ciclos de amostragem foram empregados para cada ligante, com uma eficiência de busca de 200%, considerada como altamente preditiva. As múltiplas soluções de docking geradas foram classificadas como distintas quando o desvio quadrático médio de átomos pesados entre as poses foi superior a 1 Å. A função de escore GoldScore foi definida para o ranqueamento das poses já que foi a que produziu os melhores resultados nas simulações de redocking do ligante cristalográfico, com um desvio quadrático médio de átomos pesados de 0,54 Å.
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