Construction et apprentissage du HMM

É a ciência que estuda o conjunto de proteínas expressas a partir de um genoma, em resposta a uma determinada situação, contidas em um compartimento ou fluído e submetidas a eventuais modificações pós-traducionais (SILVA; CORREA, 2007). Utiliza métodos diretos para identificar, quantificar e estudar as modificações pós traducionais das proteínas em uma célula, tecido ou mesmo organismos (WESTERMEIER; NAVE, 2002). O termo já sofreu diversos ajustes desde que foi introduzido na literatura por Marc Wilkins e Keith Williams em 1995 (SOUSA et al., 2001). Normalmente 80% ou 90% dos polipeptídeos de um proteoma celular correspondem a componentes das redes metabólicas e dos elementos estruturais da célula, sendo encontrados, embora em diferentes quantidades, em todos os tipos de células (WILKIN; PASQUALI; APPEL, 1996). Os estudos de análise proteômica complementam os dados de análise e seqüenciamento de genomas, auxiliando na compreensão do funcionamento e

regulação celular, representando a ponte de ligação entre o genótipo e o fenótipo de um organismo. Atualmente, estudos têm sido realizados para a obtenção de mapas proteômicos de neutrófilos quiescentes, estimulados e ativados, (AQUINO, 2008; CAMPOS, 2007; CASTRO et al., 2006; SANTOS, 2007) ou mesmo de estruturas subcelulares (LOMINADZE et al., 2005).

A análise proteômica permite saber se um produto gênico está sendo expresso, a concentração relativa (ou absoluta) desse produto e as modificações pós- traducionais que podem ocorrer nessas proteínas. Além disso, o proteoma pode mostrar como os processos metabólicos, regulatórios e de sinalização se tornam disfuncionais em dados estados patológicos e como podem ser manipulados na busca por soluções terapêuticas (ANDERSON; MATHESON; STEINER, 2000). O estudo proteômico divide-se basicamente em duas etapas: a primeira consiste na extração e separação das proteínas a partir do material de origem, baseando-se em propriedades intrínsecas de cada proteína como a massa molecular e o estado de suas cargas; e a segunda na identificação e quantificação de cada proteína usando técnicas de espectrometria de massa (SANTOS, 2007). Diversas técnicas podem ser utilizadas para a realização de tais etapas. No presente estudo optou-se pelo uso da eletroforese bidimensional para a separação de proteínas e pela espectrometria do tipo MALDI-TOF/TOF para a identificação de proteínas com base nas massas de seus peptídios e seus respectivos padrões de fragmentação. Tal escolha baseou-se principalmente na existência prévia de géis de proteínas de neutrófilos expostos a outras condições, o que viabilizará comparações futuras.

1.13.1 Eletroforese Bidimensional

Nesta técnica a separação dos componentes de uma amostra ocorre de acordo com duas propriedades independentes, em dois passos: (1) primeira dimensão – focalização isoelétrica (IEF); e (2) segunda dimensão – gel de poliacrilamida – SDS (SDS – PAGE). No primeiro passo as proteínas são separadas de acordo com o ponto isoelétrico (pI) das proteínas. Na segunda dimensão, a separação ocorre baseada no peso molecular (MW). Dessa forma, em apenas uma corrida, milhares de proteínas podem ser separadas e, além disso, podem ser obtidas diversas informações, como ponto isoelétrico, peso molecular e quantidade de cada proteína detectada (NEVES, 2010).

1.13.2 Análise de Imagens

Este tipo de análise é muito útil para se comparar cada proteína ou conjunto de proteínas (spots) visualizadas em vários géis. O programa de computação, Image

Master Platinum GE® (MACHADO et al., 2010), agrupa os géis de acordo com a

condição experimental, por exemplo, antes e após um estímulo, e depois se faz um pareamento entre os géis de cada condição e entre os géis representativos das duas condições. Essa ferramenta também permite a quantificação de cada spot, gerando dados de proteínas diferencialmente expressas em cada condição e de proteínas ausentes ou presentes em apenas uma das condições estudadas.

1.13.3 Espectrometria de Massa

Os spots, visualizados pela coloração (ex.: prata), num gel 2D-PAGE, são cortados e digeridos, geralmente pela enzima tripsina, originando peptídeos que se ionizam em um espectrômetro de massa e terão suas massas moleculares, bem como regiões de sua sequência determinadas. O conjunto de massas moleculares e trechos de sequência dos peptídeos é comparado a conjuntos teóricos obtidos de cada uma das proteínas presentes num banco de dados. A proteína cujo padrão de digestão teórica for mais similar ao obtido experimentalmente é considerada identificada.

Um espectrômetro de massas é um instrumento analítico que converte componentes de uma amostra em íons gasosos e mede suas massas. Em um espectrômetro de massas, os íons são separados de acordo com sua relação massa/carga (m/z). A massa dos íons é medida por unidades de massa atômica (u.m.a.) ou Daltons (Da), os quais são definidos como 1/12 da massa de um átomo de C12.O espectrômetro de massas consiste-se de cinco componentes principais: sistema de injeção de amostra, fonte de íons, analisador, detector e processador de sinais.

No presente trabalho foi utilizado um espectrômetro do tipo MALDI-TOF-TOF (MALDI – matrix-assisted laser desorption ionization ; TOF - time of flight). A ionização por MALDI usa pulsos de laser os quais excitam uma matriz que é, adsorvida aos peptídeos das proteínas digeridas. A matriz adsorvida aos peptídeos

é convertida em uma fase gasosa contendo íons, o que induz a ionização dos peptídeos. Esses íons são então acelerados em um campo elétrico, para serem posteriormente detectados. O tipo de análise chamado TOF mede a razão massa/carga de um íon peptídico de acordo com o tempo que ele percorre uma região livre de campo elétrico até o detector (VORM; ROEPSTORFF; MANN, 1994). Depois dessa etapa, segue-se a análise da impressão digital de fragmentos peptídicos (peptide mass fingerprinting). Uma série de massas de peptídeos, obtidas por análise de espectrometria de massa, pode servir como uma impressão digital, pois o digesto triptico é específico para cada proteína (KUMARATHASAN et al., 2005). Portanto, uma série de massas determinadas a partir de MALDI-TOF é comparada com aquelas calculadas a partir da digestão teórica de seqüências existentes em bancos de dados disponíveis na Internet, levando à identificação da proteína. Tal identificação pode ainda ser aperfeiçoada (ex.: MALDI TOF-TOF) acrescentando-se ao conjunto de massas de peptídeos, fragmentos de seqüência obtidos através de sequence tags (trechos de seqüências), o que permite a identificação com apenas um fragmento, ou ainda outros dados obtidos na eletroforese como pI e massa molecular aproximada da proteína estudada (ROEPSTORFF, 1997; WILKINS et al., 1997). O princípio do MALDI-TOF-TOF é o mesmo, porém os peptídeos selecionados são fragmentados por ação de uma alta energia ou pela colisão de um gás inerte como argônio. Os peptídeos tendem a se romper na ligação peptídica, gerando fragmentos menores. Os fragmentos são novamente acelerados soltos no TOF e detectados cada um ao seu tempo pela diferença de m/z. Os sinais também são transformados em espectros contendo picos (ANDERSON et al., 2000).