Construction des mutants dépourvus de glutarédoxines

Les constructions des mutants d’inactivation ont été réalisées en substituant indépendamment (simples mutants) ou successivement (mutants multiples) la phase codante des gènes codant pour les glutarédoxines par un gène marqueur codant pour la résistance à un antibiotique (kmr, s mr, c mr) (voir Matériel et Méthodes). Les cassettes de résistance sont dépourvues de terminateurs de transcription, ce qui permet de ne pas affecter l’expression des gènes situés en aval des gènes inactivés.

Les cassettes de délétion construites, soit les constructions grx1::Km, grx2::Sm, grx3::Cm ont été introduites indépendamment dans Synechocystis par transformation (voir Matériel et Méthodes et Figure 35) pour obtenir chacun des simples mutants (

Tableau 7).

Plasmide Description

Plasmides utilisés

pGEMt Vecteur de clonage AT AmpR_(Promega)

pUC4K Source du marqueur KmR_(Pharmacia)

pFC1 Source des marqueurs SmR_{(Prentki P, 1991) et Cm}R_{(Mermet-Bouvier, 1994)}

Plasmides hébergeant les gènes codant pour les glutarédoxines Synechocystis

pGEMt avec le gène grx1 flanqué par 300 pb en amont du codon « start » et 300 pb en aval du codon stop

pGEMt avec le gène grx2 flanqué par 267 pb en amont du codon « start » et 307 pb en aval du codon stop (construit par F. Domain)

pGEMt avec le gène grx3 flanqué par 300 pb en amont du codon « start » et 300 pb en aval du codon stop

Construction des cassettes d’inactivation pGrx2

pGrx3

pDGrx1 pDGrx2 pDGrx3

pGrx1 avec le marqueur KmR_{inséré entre les nucléotides 5 et 104 de grx1}

pGrx2 avec le marqueur SmR_{inséré en sens inverse à la place de grx2}

pGrx3 avec le marqueur CmR_{inséré entre les nucléotides 2 et 99 de grx3}

pGrx1

Plasmide Description

Plasmides utilisés

pGEMt Vecteur de clonage AT AmpR_(Promega)

pUC4K Source du marqueur KmR_(Pharmacia)

pFC1 Source des marqueurs SmR_{(Prentki P, 1991) et Cm}R_{(Mermet-Bouvier, 1994)}

Plasmides hébergeant les gènes codant pour les glutarédoxines Synechocystis

pGEMt avec le gène grx1 flanqué par 300 pb en amont du codon « start » et 300 pb en aval du codon stop

pGEMt avec le gène grx2 flanqué par 267 pb en amont du codon « start » et 307 pb en aval du codon stop (construit par F. Domain)

pGEMt avec le gène grx3 flanqué par 300 pb en amont du codon « start » et 300 pb en aval du codon stop

Construction des cassettes d’inactivation pGrx2

pGrx3

pDGrx1 pDGrx2 pDGrx3

pGrx1 avec le marqueur KmR_{inséré entre les nucléotides 5 et 104 de grx1}

pGrx2 avec le marqueur SmR_{inséré en sens inverse à la place de grx2}

pGrx3 avec le marqueur CmR_{inséré entre les nucléotides 2 et 99 de grx3}

pGrx1

Tableau 7 : Constructions des cassettes d’inactivation des glutarédoxines de Synechocystis. D’après les références [251], [25]

J’ai ensuite construit les doubles mutants Dgrx1Dgrx2 et Dgrx1Dgrx3 en introduisant respectivement les constructions grx2::Sm et grx3::Cm dans le mutant Dgrx1. Le mutant Dgrx2Dgrx3 a été obtenu en introduisant la construction grx3::Cm dans le mutant Dgrx2. Enfin, le triple mutant Dgrx1Dgrx2Dgrx3 a été obtenu en introduisant la construction grx3::Cm dans le mutant Dgrx1Dgrx2.

a b gène a b gène a b Kmr a _b gène I. Construction de la cassette de délétion Kmr a b

II. Introduction par transformation

Insertion de la cassette KmR

dans une copie du génome par recombinaison

gène a b a Kmr b gène a b a Kmr b Kmr a b a Kmr b

III. Croissance en présence de doses croissantes de kanamycine

Gène non essentiel:

Ségrégation complète des chromosomes Gène essentiel à la viabilité cellulaire:

les cellules conservent des chromosomes sauvages

Figure 35 : Principe de l’inactivation d’un gène par transformation chez Synechocystis. Après transformation, les différentes copies sauvages sont ségrégées en exerçant une pression de sélection. Synechocystis possède 10 copies de chromosome, seules deux d’entre elles sont représentées dans ce schéma.

La transformation ne permet la substitution que d'une copie sauvage du gène ciblé. Les autres copies sauvages sont ségrégées en exerçant une pression de sélection avec l'antibiotique correspondant. Toutes les constructions ont été vérifiées par PCR et séquençage. Les PCR permettent de vérifier que les cassettes sont intégrées correctement dans le génome ainsi que la présence de copie de chromosome sauvage. Aucune copie sauvage ne doit réapparaître lorsque la pression de sélection est relâchée. La ségrégation est totale si le gène n'est pas essentiel à la viabilité cellulaire dans les conditions physiologiques testées (voir Figure 35).

Tous ces mutants (simples et multiples) sont viables en conditions standard de croissance. Toutes les copies de chromosomes sauvages ont été totalement ségrégées (vérification par PCR, voir Matériel et Méthodes). Ces gènes ne sont donc pas essentiels à la viabilité cellulaire. Cependant, l’inactivation du gène grx3 entraîne une augmentation du temps de génération de la souche mutante correspondante (Dgrx3) et également de celles des souches Dgrx1Dgrx3, Dgrx2Dgrx3 et Dgrx1Dgrx2Dgrx3 (Tableau 9).

Souches Temps de génération (h)

(conditions standards de croissance)

Souche sauvage (WT) 10 ± 1 Dgrx1 10 ± 1 Dgrx2 10 ± 1 Dgrx3 20 ±1 Dgrx1Dgrx3 20 ± 1 Dgrx2Dgrx3 20 ± 1 Dgrx1Dgrx2Dgrx3 20 ± 1

Tableau 9 : L’inactivation de grx3 entraine une augmentation du temps de génération. Temps de génération des différentes souches mutantes et sauvage dans des conditions standard de croissance.

Le mutant D grx1Dgrx2Dgrx3 est viable. Ceci met en évidence que le système glutarédoxine n’est pas indispensable à la viabilité cellulaire dans des conditions standard de croissance. Ce résultat est à mettre en parallèle avec l’existence d’un autre système de contrôle de l’homéostasie des thiols cellulaires, les thiorédoxines (Trxs). En effet, dans des conditions standard de croissance, il a été démontré, chez S. cerevisiae, que la seule présence de l’un ou de l’autre de ces systèmes est suffisante à la croissance cellulaire [68]. Nous pouvons donc supposer que chez Synechocystis les thiorédoxines possèdent des fonctions redondantes avec les glutarédoxines. L’inverse ne semble pas être vrai car il a été montré qu’au moins trois des cinq thiorédoxines de Synechocystis sont indispensables à la viabilité cellulaire (TrxM2 (Sll1057), TrxA2 (Slr1139), TrxA3 (Sll1980)) [252]. Il est même possible que TrxA1 (Slr0623) soit également essentielle à la viabilité cellulaire [253], ce résultat n’a pas été confirmé par [252]).