No início da década de 80, Barker constatou que alterações no ambiente intrauterino e em importantes fases do desenvolvimento, como durante a lactação, infância e adolescência podem levar os indivíduos a apresentar disfunções metabólicas na vida adulta (79). Diversos pesquisadores do mundo todo também constataram essas alterações (80–82). Esses estudos deram origem ao fenômeno conhecido como origem fetal das doenças do adulto, publicado por Barker em 1995 (83). Desde então, cientistas de todo o mundo buscam entender quais são os determinantes que levam à chamada programação metabólica fetal, ou melhor, como as alterações maternas levam a diferentes desfechos fetais.
Um dos primeiros trabalhos do nosso grupo mostrou, em modelos animais, que a obesidade materna é capaz de induzir alterações no fenótipo da prole, como maior adiposidade, resistência hepática à insulina e maior deposição de gordura hepática (84). Em 2014, demonstramos que a prole de mães obesas recém desmamada (28 dias) apresenta acúmulo de gordura no tecido hepático, com concomitante aumento de marcadores hepáticos relacionados à síntese de triacilglicerol e diminuição da oxidação de ácidos graxos (13) e que tais alterações relacionam-se com o aumento na expressão de miR-370 e diminuição na expressão de miR-122 no fígado. Também demonstramos que a modulação de ambos microRNAs perdura até a vida adulta, estando presente desde o nascimento, o que demonstra que tais alterações hepáticas são decorrentes de insultos tanto na gestação como na lactação (75).
Uma vez que o acúmulo de gordura no fígado pode levar ao desenvolvimento de DHGNA, doença que atinge cerca de 25% da população e, a estimativa é de que mais de 20% desses pacientes irão passar por algum procedimento de ressecção hepática como estratégia para tentar reverter o desenvolvimento de tumores malignos hepáticos, é de grande importância compreender os fatores que desencadeiam tal acúmulo no fígado, visto que o fígado esteatótico não apresenta a mesma capacidade regenerativa de um fígado saudável (18–20,23,85). Assim, surgiu a hipótese do presente trabalho, de que a prole de mães obesas poderia apresentar uma resposta prejudicada ao ser submetida ao procedimento de ressecção hepática, devido às alterações possivelmente desencadeadas por mecanismos epigenéticos, como a modulação de microRNAs.
A caracterização de nosso grupo experimental demonstra, como observado previamente (13,75,84), que a prole de mães obesas apresenta maior adiposidade que a prole de mães controle. No entanto, ambas, quando submetidas à hepatectomia parcial, apresentam aumento nos níveis das transaminases ALT e AST, o que nos indica que esses animais apresentam danos hepáticos similares após a cirurgia, independentemente do tipo de dieta que a mãe consumiu.
Um dado que reforça essa observação é que a totalidade dos animais submetidos ao procedimento de ressecção hepática sobreviveu, independentemente da dieta à que a mãe foi exposta, como mostrado pela curva de sobrevivência. Somado a isso, não foram observadas diferenças entre HF e CT com relação à massa de tecido hepático regenerado, tanto após 4h, como após 48h de cirurgia. Certamente, quatro horas é um período muito agudo após a cirurgia para se observar diferença entre o peso do fígado desses animais, uma vez que esse tempo foi estabelecido para avaliarmos o início da sinalização para regeneração hepática. Com 48 horas é quando observa-se o pico de síntese de DNA em animais que passaram pelo procedimento de PHx (86). No entanto, nenhuma diferença significativa entre os grupos foi observada, sugerindo que caso houvesse prejuízo no processo de regeneração, tal prejuízo não foi capaz de alterar drasticamente o peso do fígado, ou ainda, que tal medida não foi sensível o suficiente para representar qualquer tipo de alteração de massa.
No entanto, os resultados da avaliação de marcadores de proliferação celular por imunofluorescência mostram um maior número de células positivas para Ki67 no grupo CT em comparação com o grupo HF, sugerindo melhor
capacidade regenerativa da prole controle 48 horas após a cirurgia de hepatectomia parcial. Entretanto, a menor capacidade proliferativa atribuída ao grupo HF pode ser decorrente não de uma incapacidade dos animais em regenerar o tecido, mas a um atraso no processo de regeneração, que ao final, não compromete o processo e garante a sobrevivência do animal.
Animais obesos que apresentam acúmulo de gordura no fígado possuem maiores chances de complicações e morte após cirurgia de hepatectomia parcial (18,19), possivelmente relacionados a um prejuízo no fluxo sanguíneo no fígado (20,21), à perda do controle fino do metabolismo celular (22,23) e à desregulação de proteínas pró e antiapoptóticas como Bcl-2, Bcl-x e Bax (24).
Como mencionado anteriormente, nossa hipótese era de que o aumento na expressão de miR-370 e diminuição de miR-122 poderia levar a um prejuízo no processo de regeneração hepática da prole de mães que consumiram dieta hiperlipídica (HF). Observamos no presente modelo que existe uma tendência de redução da expressão de miR-122 e aumento de miR-370 na prole de mães obesas antes do procedimento cirúrgico, o que vai ao encontro dos resultados anteriormente obtidos por nosso grupo (13,75). Essa variação observada nos níveis desses microRNAs foi apontada como determinante para o aumento da deposição de TG no hepatócito (uma vez que a redução de miR-122 promove maior expressão de enzimas da via de síntese de triglicérides) e redução da oxidação de ácidos graxos (uma vez que o aumento de miR-370 promove redução da expressão de CPT1 e ACADVL) (13,75). Logo após a cirurgia de hepatectomia, essa tendência de diferença entre os grupos CT e HF se inverte para o miR-122, mas não para o miR-370, que permanece aumentado mesmo após 48 horas de cirurgia no grupo HF.
Uma possibilidade para explicar os resultados observados baseia-se no fato da expressão de miR-122 ser determinante para o controle da síntese de TG. A tendência de aumento de miR-122 observado após 4 horas de cirurgia poderia acarretar em uma diminuição na síntese de TG e consequente redução do quadro de esteatose transitória, observado em situações normais durante o processo regenerativo hepático e de grande importância para a nutrição do tecido durante o processo (87). O acúmulo de lipídios, principalmente triglicerídeos, ocorre a partir de 4 horas após o procedimento cirúrgico mas tem seu pico com 24 horas após a hepatectomia parcial, caracterizando a esteatose transitória que é de extrema importância para o processo regenerativo (87,88), a inibição da enzima ácido graxo sintase está relacionada a inibição da proliferação (89,90). No entanto, os resultados de histoquímica com oil red refutam essa hipótese, uma vez que não foram observadas diferenças entre a prole HF e CT, mostrando que a reversão da expressão de miR-122 induziu menor depósito de lipídeos no interior dos hepatócitos, mas ainda assim a síntese foi eficiente para indução do quadro de esteatose transitória, igualando- se à prole CT.
Com relação às alterações observadas para o miR-370 48hs após hepatectomia parcial, da mesma forma que foi observado antes da cirurgia, o aumento desse microRNA no fígado da prole poderia representar um prejuízo para a regeneração desse tecido. Zhu e colaboradores mostraram que os níveis de miR-370 elevam-se após longo período de isquemia-reperfusão (IR), induzindo injúria hepática através da modulação positiva da via do NFkB e que o uso de inibidores de miR-370 poderiam reduzir o dano hepático e os níveis séricos das transaminases AST e ALT decorrentes do processo de IR (91).
Em conjunto, os resultados de modulação dos microRNAs estudados poderiam indicar ao menos uma pequena alteração decorrente da dieta materna. No entanto, o prejuízo observado parece ser muito pequeno frente ao insulto e, muito provavelmente, a prole tenha sido programada para apresentar uma resposta satisfatória frente a situações ambientais adversas visando a sobrevivência do animal.
Análises computacionais apontaram duas importantes vias moduladas por esses miRNAs, a via Hippo/YAP e a via do TGFβ. miR-370 apareceu como modulador tanto da expressão de Smad3 como de YAP, enquanto miR-122 apareceu como modulador da expressão de NF2 (elemento da via da Hippo). No entanto, a literatura mostra, através de análises de transcriptoma, que a atividade de YAP, tanto em fígados normais, quanto em hepatocarcinomas, relaciona-se com a modulação negativa de alvos de HNF4a, como miR-122 (92). A deleção de HNF4a em fígado de camundongos adultos leva a um fenótipo semelhante ao observado durante ativação de YAP, incluindo alteração morfológica e funcional de hepatócitos e proliferação de hepatócitos desdiferenciados (93). Varelas e colaboradores demonstraram que em resposta do TGFβ, TAZ se liga ao complexo Smad impedindo a sua exportação para o citoplasma, o que levaria a um maior bloqueio do ciclo celular, levando ao prejuízo na regeneração hepática (69). Tais fatos reforçam o possível crosstalk entre os microRNAs-370 e -122, não somente na modulação do metabolismo lipídico hepático, como também no controle da proliferação desse tecido.
A expressão de YAP mostrou-se pouco alterada no grupo HF quando considera-se o estímulo agudo da hepatectomia parcial. A quantidade de transcrito foi modificada somente 48hs após PHx. Observamos que após 48
horas da cirurgia de hepatectomia parcial a prole de mães que consumiram dieta rica em lipídios (HF) apresentou uma menor expressão de YAP quando comparada com a prole de mães que consumiram dieta controle (CT). Ao compararmos o efeito da cirurgia observamos que os animais HF apresentaram diminuição na expressão de YAP quando comparados com 0h de cirurgia, ou seja, quando comparados com a expressão basal. Como YAP é uma proteína de extrema importância para o controle do tamanho do órgão, ao observarmos variações distintas entre os grupos, podemos supor uma possível resposta distinta quanto ao controle fino da proliferação e apoptose entre a prole de mães que consumiram dieta hiperlipídica quando comparado com a prole de mães que consumiram dieta controle. YAP é um possível gene alvo tanto do miR-370, quanto do miR-122. No entanto, não conseguimos observar uma relação concreta entre a modulação da expressão desses microRNAs e a expressão de YAP. Cerca de 4hs após PHx os níveis de transcrito para miR-122 estão bastante elevados em ambos grupos, enquanto a quantidade de mRNA para YAP está reduzida, o que poderia indicar uma modulação desse gene pelo microRNA. Porém, com 48hs de cirurgia, miR-122 teve sua expressão reduzida em ambos os grupos e YAP parece ter seguido o mesmo perfil de expressão desse microRNA. Se observarmos a expressão de miR-370, o resultado observado para a expressão de YAP após 48hs nos leva a crer que esse gene seja um possível alvo para miR-370. No entanto, a expressão de ambos, miR-370 e YAP, 4hs após PHx não condiz com uma possível relação de modulação microRNA- alvo. Tal achado nos levou a supor que, ou YAP não é alvo de miR-122 e miR- 370 ou o mecanismo de sobrevivência do animal se sobrepõe ao mecanismo epigenético. Entretanto, não podemos deixar de apontar para a tendência de
aumento de miR-122 no grupo HF após 48hs de PHx, comparada ao grupo CT e à redução de YAP, o que poderia ser um indicativo de um “leve” prejuízo na via, modulado pela expressão de miR-122 na prole de mães obesas.
Da mesma forma, nas análises in silico, o gene da NF2 foi apontado como um possível alvo de miR-122. No entanto, não observamos padrões de modulação que comprovassem essa relação.
No entanto, a expressão de Smad2/3, uma importante proteína da via de sinalização do TGFβ, mostrou-se aumentada nos animais HF, comparados aos CT, tanto no tempo basal (antes da cirurgia), como 4 horas após a cirurgia. A via do TGFβ possui papel importante para bloqueio do ciclo celular, portanto, a diminuição na expressão de Smad3 no tempo agudo seria importante para que as células conseguissem dar continuidade para a progressão do ciclo celular e proliferação. A Smad2/3 seria um possível gene alvo do miR-370, no entanto, assim como os demais genes, não conseguimos encontrar uma relação entre a modulação dos microRNAs e a expressão gênicas dessas proteínas. Porém, se observarmos a expressão de Smad2/3 4hs após a PHx notamos que a prole HF apresenta um aumento em relação à prole CT, sugerindo uma maior ativação da via e prejuízo no processo regenerativo nesse grupo. Esses resultados corroboram com os de Wester Blot, uma vez que os animais HF apresentam uma tendência a ter maior razão pSmad3/Smad3 48 horas após a cirurgia, o que poderia justificar um possível prejuízo na regeneração hepática observada na marcação com Ki67 da prole de mães que consumiram dieta rica em lipídios.
Dados da literatura mostram que indivíduos obesos apresentam níveis aumentados de TGFβ (61–63). Além disso, observa-se em indivíduos obesos uma dificuldade na regeneração hepática após injúria química ou mecânica
(94,95). Tais observações podem estar relacionadas e contribuir para o prejuízo desse processo no fígado. Nossos resultados são sugestivos de um “leve” prejuízo na regeneração também, em parte, pela maior ativação da via do TGFβ.
Adicionalmente, já é muito bem descrito na literatura que animais obesos apresentam níveis aumentados de outras citocinas pró-inflamatórias, como IL1β e TNFα (96,97). Também já é conhecido que a prole de mães obesas apresenta um quadro inflamatório, diferentemente do observado para a prole de mães controle (14). Somado a isso, trabalhos na literatura mostram que o aumento de citocinas pró-inflamatórias, como TNFα e IL1β podem estimular a apoptose durante o processo de regeneração tecidual, contribuindo para a manutenção do tamanho do órgão na fase de progressão do processo regenerativo. No entanto, o aumento agudo dessas citocinas (ou seja, na fase de iniciação, como observada após 4 hs de PHx) poderia sugerir um prejuízo para o processo, por estimular agudamente a morte celular (98). Esses resultados parecem concordar com os resultados de aumento de miR-370 observado na prole HF e com o efeito observado por Zhu e colaboradores em 2017 (91).
No que diz respeito ao processo de regeneração hepática, IL6 é a citocina mais importante e necessária para desencadear a sinalização inflamatória inicial, fundamental para a regeneração tecidual (10,72,74,99). Essa citocina é responsável por ativar pelo menos duas vias essenciais, uma por meio do seu receptor IL6R, ativando Jak-STAT3, levando à transcrição de genes proliferativos, e outra por meio da Ras, resultando na ativação de proteínas reguladoras da síntese de DNA, como a PCNA (100). Indivíduos obesos e que desenvolvem esteatose hepática, demonstram prejuízo na sinalização de IL6, o que leva à falha na síntese de DNA (25). Em nosso modelo experimental
observamos que, independentemente da dieta materna, os níveis de transcrito para IL6 aumentam muito, de modo agudo, logo após o procedimento cirúrgico (4h pós PHx), demonstrando que mesmo a prole HF mostrou-se capaz de disparar o sinal inflamatório necessário para a proliferação hepática.
De modo geral, o presente trabalho nega a hipótese de que a prole de mães obesas apresenta distúrbios na regeneração hepática decorrentes de alterações de dois importantes microRNAs envolvidos com a modulação do metabolismo lipídico hepático, miR-122 e miR-370. Nossos resultados são apenas sugestivos de um “leve” prejuízo na regeneração, possivelmente decorrente de um atraso na fase de progressão do processo regenerativo, mas que, no final, não altera a sobrevivência da prole.