Conformation structurale de la RhlA

À l’heure actuelle, la structure tridimensionnelle de la RhlA n’a pas encore été rapportée. Cependant, le rôle catalytique de cette enzyme ainsi que des prédictions de ses structures secondaire et tertiaire suggèrent un repliement de type α/β (Fig. S2) (Wittgens et al., 2017). Il s’agit d’un domaine structural central typiquement formé par 8 brins β connectés par 6 hélices α (Ollis et al., 1992), autour duquel se greffent divers motifs responsables des propriétés catalytiques spécifiques et de la spécificité envers le substrat. Le site catalytique des estérases est constitué d’un résidu nucléophile qui est typiquement une sérine, d'une histidine et d'un acide carboxylique (Asp, Glu) (Arpigny & Jaeger, 1999). Chez RhlA, la sérine catalytique est localisée dans un pentapeptide hautement conservé chez les estérases. Cette séquence, GXSXG, est située à l'extrémité C-terminale du brin β5 et suivie d'une hélice α (Wittgens et al., 2017).

Une caractéristique structurale remarquable chez plusieurs hydrolases est la présence d’une région amphiphile qui couvre leur site actif. Généralement placée entre les brins β6 et β7, cette région constitue un volet qui peut être composé d’une boucle ou de plusieurs hélices α (Nardini & Dijkstra, 1999a). Le rôle de ce volet dans l’activité enzymatique est complexe, car il est associé aux interactions spécifiques avec le substrat, et même à l’activation interfaciale chez les lipases (Khan et al., 2017b).

Étant étroitement associé avec le site actif, le volet peut être impliqué dans la conformation du canal d’accès au substrat, connectant le site actif avec la surface de la protéine. De plus, cette région peut jouer un rôle majeur dans la sélectivité du substrat et dans l’activité enzymatique. L’étude effectuée par Dugi et al. (1995) a montré que l’activité hydrolytique envers les triglycérides et les phospholipides de lipases spécifiques peut être modulée par le remplacement de la région formant le volet. Dans cette étude, une lipase lipoprotéique chimérique (LPLC) comportant le volet de la lipase hépatique humaine (HL) a montré une diminution de 3.3 fois de son activité hydrolytique envers les triglycérides et une augmentation de 327% de son activité phospholipase en comparaison avec la LPL native. À l’opposé, la lipase hépatique chimérique (HLC) contenant le volet de la LPL a montré une activité accrue envers les triglycérides de 123% et une diminution de l’activité hydrolytique des phospholipides de 30% en comparaison avec la HL native (Dugi et al., 1995b). Par ailleurs, une sélectivité modulée par le volet a également été observée chez les lipases ayant leur site actif exposé à la surface. En effet, lors d’une étude présentée par Boersma et al. (2008), une

approche chimérique au niveau du volet a permis d’intervertir l’énantiosélectivité de la lipase A de Bacillus subtilis (LipA). Ces protéines chimériques ont été générées par un échange de la boucle formant le volet au sein de la cutinase de Fusarium solani et de l’acétylxylane estérase de Penicillium purpurogenum (Boersma et al., 2008a). Enfin, d’autres recherches ont utilisé des approches chimériques similaires (nommée lid swapping) pour l’étude de la sélectivité et de l’activité enzymatique des hydrolases d’origine microbienne, par exemple chez les lipases de

Candida rugosa (CRLs) (Brocca et al., 2003a, Secundo et al., 2004b), de Rhizopus oryzae

(Shiraga et al., 2005a) et de Rhizopus chinensis (Yu et al., 2014b).

3.2 Problématique

L’engouement pour les surfactants biologiques et, particulièrement les rhamnolipides, fait écho au grand défi visant à remplacer les produits synthétiques pour réduire la contamination des écosystèmes aquatiques à la source et favoriser la biorestauration. Cependant, la croissance de cette technologie est confrontée à plusieurs obstacles qui empêchent les différents secteurs de l’industrie d’en tirer profit. Notamment, les coûts de production très élevés constituent un problème majeur.

Grâce au génie de protéines, il a été possible de moduler la sélectivité et d’augmenter l’activité catalytique de plusieurs hydrolases (Khan et al., 2017b). Particulièrement, les avancées en protéomique, en biologie structurale et en bioinformatique appliquée constituent un puissant ensemble de technologies favorisant l’émergence de la biologie de synthèse et l’étude de la conformation des protéines et leurs interactions.

Le génie des protéines se présente donc comme une technologie attrayante pouvant s’appliquer à la biosynthèse de rhamnolipides, mais le manque de caractérisation fonctionnelle et structurale des enzymes qui s’y rattachent constitue un obstacle majeur. De plus, le manque de méthodes de criblage à haut débit pour identifier les variants surproducteurs de rhamnolipides est un facteur limitant à l’égard de l’ampleur des modifications génétiques qui seraient engendrées afin de faire évoluer une protéine vers une activité spécifique recherchée.

3.3 Hypothèse

Deux aspects font l’objet d‘une grande attention concernant les rhamnolipides : l’amélioration de la productivité à faible coût et la diversification de leurs propriétés via l’obtention de mélanges de congénères spécifiques ou purs. À l’heure actuelle, l’enzyme RhlA, jouant un rôle clé dans la biosynthèse de précurseurs lipidiques de rhamnolipides, constitue la candidate à cibler tant pour augmenter le flux de précurseurs dans la voie biosynthétique que pour moduler le profil des acides gras générés et formant ces glycolipides.

Par ailleurs, la diversité phylogénétique de RhlA peut être utile pour étudier les éléments structuraux qui gouvernent sa sélectivité pour son substrat. Si de tels éléments sont identifiés à la base, il est possible de mettre en place des stratégies d’évolution non aléatoires, telle l’évolution semi-rationnelle, où l’ampleur des modifications génétiques peut être limité, permettant ainsi l’analyse des variants générés par des méthodes analytiques n’étant pas optimisées pour un criblage à haut débit.

3.4 Objectifs du chapitre

Le présent chapitre met l’accent sur le recours à une stratégie d’évolution semi- rationnelle ayant pour objectif la modulation de la sélectivité du substrat et l’augmentation de l’efficacité catalytique de l’enzyme RhlA de P. aeruginosa. Les objectifs spécifiques du chapitre sont :

Le présent chapitre met l’accent sur le recours à une stratégie d’évolution semi-rationnelle ayant pour objectif la modulation de la sélectivité de substrat et l’augmentation de l’efficacité catalytique de l’enzyme RhlA de P. aeruginosa. Les objectifs spécifiques du chapitre sont :

i. Déterminer le rôle de RhlA dans les profils de congénères distincts observés chez

P. aeruginosa et B. glumae.

ii. Identifier la région de la séquence primaire et les éléments structuraux putatifs qui modulent la reconnaissance du substrat et la sélectivité de RhlA.

iii. Effectuer une exploration mutationnelle du site actif pour augmenter l’efficacité catalytique de RhlA.

3.5 Méthodologie et approche globale

L’étude de l’enzyme RhlA présentée ici est principalement basée sur la caractérisation des régions de la protéine impliquées dans la formation du site actif et la reconnaissance du substrat. Premièrement, le rôle de RhlA dans le profil de congénères de rhamnolipides produits chez P. aeruginosa et chez B. glumae a été étudié via une approche de complémentation croisée de mutants rhlA- (Fig. 3.3). L’espèce B. glumae produisant un profil de congénères de rhamnolipides très différent de celui de P. aeruginosa a été jugée idéale pour cet objectif.

Figure 3.3. Schéma de la complémentation croisée des mutants rhlA- de P. aeruginosa et B. glumae.

Chez le mutant PA14_rhlA::TnMr7 (ayant un effet polaire sur le gène rhlB), la production de HAA et des rhamnolipides est interrompue. La complémentation est effectuée parallèlement avec l’opéron natif rhlAPa-rhlBPa (Pa : P. aeruginosa) et l’opéron chimérique rhlABg-rhlBPa (Bg : B. glumae).

Par la suite, un modèle par homologie de RhlA de P. aeruginosa a été construit et évalué en utilisant plusieurs outils bioinformatiques. Des outils de prédiction ont également permis d’identifier les résidus catalytiques et des résidus qui interagissent éventuellement avec le substrat au site actif. Ces prédictions ont été validées de façon expérimentale par mutagénèse dirigée; les différents congénères de rhamnolipides produits par ces mutants ont été

caractérisés et quantifiés par une méthode de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. L’analyse du modèle par homologie et des résultats obtenus lors des mutations effectuées au site actif a dévoilé une région structurale putative de l’enzyme pouvant jouer un rôle clé dans l’interaction avec les acides gras. L’importance de cette région a été ultérieurement investiguée par une approche chimérique utilisant des éléments structuraux putatifs homologues de l’enzyme RhlA de B. glumae. Finalement, les résultats de cette approche ont permis d’établir des points de référence pour l’exploration mutationnelle de résidus placés dans les éléments structuraux qui entourent le site actif et qui éventuellement peuvent favoriser l’activité catalytique de l’enzyme (Fig. 3.4).

Figure 3.4. Diagramme de flux de l’approche d’évolution semi-rationnelle globale utilisée pour l’exploration de l’enzyme RhlA au site actif.

Cette approche cherche l’identification de motifs/résidus potentiels pour moduler la sélectivité du substrat et l’activité enzymatique de RhlAPa.