grâce à un fluorophore
III. 2.1.2.1 Conditions opératoires de mesures de la relaxivité
Les nanoparticules testées ont tout d’abord été figées dans des gels d’acrylamide pour éviter une éventuelle sédimentation des USPIO nus et leurs relaxivités ont ensuite été mesurées dans un appareil d’imagerie par résonance magnétique (IRM) clinique de 3T au centre hospitalier universitaire de Dijon permettant de travailler dans les mêmes conditions que pour les études in vivo.
III.2.1.2.1.1Préparation des gels pour les mesures magnétiques
Pour mesurer les relaxivités des nanoparticules d’oxydes de fer en imagerie par résonance magnétique, il faut que les suspensions d’USPIO soient bien homogènes : la
moindre déstabilisation pouvant influencer drastiquement les résultats obtenus29. Dans le cas d’UPSIO non modifiés en surface, leur rapide sédimentation n’a pas permis d’acquérir des données reproductibles en milieu purement aqueux. Ainsi, pour figer les suspensions et pour simuler un tissu vivant, un milieu gélifié a été choisi (Goussard 2006-2007) à base d’acrylamide.
La réaction de gélification est une polymérisation radicalaire du monomère d’acrylamide : CH2=CH-CO-NH2. Cette polymérisation a été amorcée par du persulfate d’ammonium (PSA) permettant de former des radicaux libres à partir du monomère. Cette réaction est entretenue et accélérée par le TEMED (N,N,N’,N’-tétraméthyléthylènediamine).
Pour les mesures IRM, un compromis a dû être trouvé pour la concentration en monomère lors de la gélification. En effet, plus le taux de monomère est élevé plus la polymérisation est rapide et plus il est facile de « figer » des suspensions instables. En revanche, en augmentant la concentration en monomère, le temps de relaxation T20 diminue (Tableau III.2.2). Or, il faut que le T20 du gel soit le plus élevé possible pour que les mesures
de relaxivités soient plus sensibles aux variations de concentrations en fer tout en veillant à ce que la polymérisation se fasse le plus rapidement possible. Dans notre étude, la concentration volumique en monomère choisie a été de 4,5%.
Proportion de gel d’acrylamide
dans l’eau (en % volumique) T2 0 (ms) Temps de polymérisation à 60°C 3,0 % 415 ± 27 ~20 min 4,5 % 326 ± 11 10 min 6,0 % 286 ± 21 < 5 min 9,0 % 237 ± 9 < 5 min 12,0 % 205 ± 2 < 5 min Tableau III.2.2 : Mesures du temps de relaxation T2
0
et temps de polymérisation à 60°C de différents gels d’acrylamide de différentes proportions volumiques.
Six concentrations en fer (en mMFe) ont été mélangées à la solution d’acrylamide et la réaction a été amorcée et entretenue par respectivement 20 µ L de PSA et 15 µ L de TEMED. Les tubes ont ensuite été placés à l’étuve à 60°C pendant 5 à 10 minutes. Après cette étape les gels sont formés et homogènes (Figure III.2.1). Les relaxivités ont été exprimées par rapport aux concentrations de fer quelles que soient les modifications de surface utilisées.
Figure III.2.1 : Photographies des gels d’acrylamide (à 4,5 % volumique de monomère) à différentes concentrations (C1, C2, C3, C4, C5 et C6) d’USPIO
III.2.1.2.1.2Les mesures de relaxivités
Une fois les gels préparés, ils sont analysés grâce à l’IRM clinique à 32 temps d’échos TE différents allant de 8,6 à 275,2 ms avec des pas de 8,6 ms. Plus le temps d’écho est élevé, plus le contraste est négatif. Ainsi, sur la Figure III.2.2 on peut voir le signal diminuer proportionnellement aux cinq temps d’échos et aux 6 concentrations en oxydes de fer dans les gels ; les concentrations les plus faibles étant situées dans les colonnes de tubes à gauche.
Figure III.2.2 : Clichés IRM (coupe de 5 mm) de 6 fois 6 tubes de concentrations en oxydes de fer nus croissantes de gauche à droite pour 5 temps d’échos différents dans une IRM clinique 3T en séquence
écho de spin à pondération T2.
L’acquisition des images a été réalisée sur des coupes de 5 mm au centre des gels et c’est pour cette raison qu’il fallait nécessairement travailler avec des suspensions homogènes. La mesure se faisant sur une petite coupe de l’échantillon, elle se devait d’être représentative. En effet, si cette coupe était trop ou pas assez concentrée par rapport à l’ensemble du tube, la relaxivité s’en serait vue drastiquement modifiée.
Pour chaque tube et pour les 32 temps d’échos, des mesures de niveaux de gris (noté S) ont été obtenues à l’aide du logiciel image-J (avec 0 pour le noir absolu et 2047 pour le blanc pur et donc 2048 niveaux de gris). Plus le temps d’écho est élevé, plus le contraste est négatif et le niveau de gris faible. En reportant sur un graphe l’intensité du signal mesurée en fonction du temps d’écho (en ms) (Figure III.2.3), il est possible d’établir une courbe de décroissance exponentielle et de trouver un temps de relaxation T2 (en ms) d’après l’équation :
ε
+ ⋅ = −( / ) 0 2 T T TE E e S S Eq. III.2.1 avec STE le contraste à un TE donné, S0 le contraste à TE = 0 (l’ordonnée à l’origine) et ε le bruit de fond de la mesure.Figure III.2.3 : Courbe du contraste d’un tube analysé dans une IRM clinique 3T en fonction des temps d’écho des mesures. La modélisation (en rouge) de cette courbe permet d’accéder au temps de
relaxation longitudinale T2.
Avec ces mesures, des temps T2 ont été obtenus pour les 6 concentrations d’un type d’oxyde de fer. En traçant l’inverse du T2, appelé R2 ou taux de relaxation (en s-1), en fonction de la concentration en fer des USPIO étudiés (C en mMFe), l’équation de la droite obtenue est : TE= 8,6 ms TE= 43 ms TE= 94,6 ms TE= 172 ms TE= 215 ms 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 50 100 150 200 250 300 C o n tr a s te ( u .a .) Temps d'écho (ms)
avec r2 la relaxivité de ce produit (en mMFe-1.s-1) et R20 le taux de relaxation en absence d’agent de contraste (Okuhata 1999; Bjornerud et al. 2004; Park et al. 2008).
Par exemple, dans la Figure III.2.4, les R2 des USPIO nus ont été tracés en fonction de leurs concentrations dans les gels. La relaxivité trouvée est de 260 mMFe-1.s-1 et R20 = 3,05 s-1 soit un T20 de 328 ms.
Figure III.2.4 : Courbe de relaxation R2 en fonction de la concentration en Cliavist® ayant permis de trouver sa relaxivité r2 et le taux de relaxation T20 en absence d’USPIO