6.2.1 Orexina em LCR
A ritmicidade circadiana do sistema orexinérgico já foi previamente descrita na literatura. Estudos mostram que o pico de concentração de orexina em LCR de ratos ocorre ao final da fase ativa enquanto níveis mais baixos são observados ao final da fase de claro (Desarnaud et al., 2004; Zhang et al., 2004; Fujiki et al., 2001). De maneira semelhante, Deboer e colaboradores (2004) observaram variação circadiana nas concentrações de orexina no LCR de ratos em condições de luz constante. Verificaram também que animais que possuem lesão no NSQ perdem essa ritmicidade, mostrando que o NSQ exerce controle sobre a ritmicidade desse sistema.
No nosso trabalho, não foram verificadas variações diárias nas concentrações de orexina em LCR de ratos nos grupos CT ou PS (Figura 9b). Uma diferença relevante em relação aos trabalhos citados acima é o fato de que as dosagens foram realizadas no mesmo animal e não em animais diferentes como no nosso trabalho, o que pode ter levado a uma maior variabilidade nos resultados devido a diferenças interindividuais nas concentrações desse peptídeo. Entretanto, esse desenho experimental foi escolhido pois necessitávamos coletar tecidos cerebrais para as análises de expressão gênica.
Esperávamos encontrar diferenças nas concentrações de orexina em LCR entre animais CT e PS (Figura 9b) e apesar dessas concentrações serem de fato mais elevadas nos animais do grupo PS, não houve diferença estatisticamente significante. Há trabalhos na literatura que mostram que as concentrações de orexina em LCR são mais elevadas durante a PS total em relação ao CT (Deboer et al., 2004; Desarnaud
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et al., 2004). Isso acontece porque durante a PS a atividade elétrica dos neurônios
orexinérgicos aumenta agindo no sentido de manter o estado de vigília (Modirrousta
et al., 2005). Apenas um estudo realizado em nosso grupo utilizou um protocolo de
privação de sono paradoxal com duração de 96 h e verificou que as concentrações de orexina em LCR de ratos PS são mais elevadas em comparação ao CT em ZT8 e não em ZT0 (em que os níveis basais desse peptídeo já são altos) (Pedrazzoli et al., 2004). Nesse estudo foi utilizado um tamanho amostral relativamente maior por grupo, o que não foi possível no nosso trabalho devido à quantidade elevada de grupos.
6.2.2 Expressão gênica de Hcrt e receptores
Em relação à expressão gênica da prepro-orexina, também não observamos diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (Figura 10b). Esses resultados então em acordo com outros trabalhos que não verificaram expressão circadiana para esse gene no hipotálamo de camundongos (Stutz et al., 2007) e na PeF de ratos (Wang et al., 2017). Em contrapartida, Taheri e colaboradores (2000) observaram variação diária na expressão de prepro-orexina no hipotálamo de ratos, sendo que esses níveis de expressão são elevados ao final da fase de claro e diminuem em direção à fase de escuro, com nadir por volta das 19 h. Nesse estudo, as análises foram realizadas a cada 3h em um período de 24 h, o que pode ser um dos motivos da diferença entre os resultados.
Outro fator a se considerar é que utilizamos o hipotálamo total para as análises de expressão gênica e considerando que existem áreas hipotalâmicas que são antagônicas na regulação dos estados de sono e vigília (Pereira, 1970 apud Von Economo, 1930), pode ter ocorrido uma diluição dos efeitos que esperávamos observar.
Nós analisamos também a expressão dos receptores de orexina e o receptor de orexina 1 apresentou variação na expressão ao longo do dia no córtex frontal de ratos CT, sendo que os valores mínimos de expressão ocorrem em ZT8 (Figura 11b). Esses resultados estão em acordo com os encontrados por Wang e colaboradores (2017), sendo que a acrofase da expressão gênica de Hcrtr1 ocorreu em ZT15 na PeF
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de ratos. Nesse mesmo trabalho, o receptor 2 também não apresentou variação na expressão gênica ao longo do dia.
Em animais privados de sono não observamos diferenças na expressão do
Hcrtr1 tanto no córtex frontal quanto no hipocampo. Esse resultado mostra que a
privação de sono paradoxal leva à perda da variação diária na expressão do Hcrtr1 no córtex frontal. Em um trabalho publicado anteriormente em nosso grupo, ambos os receptores de orexina não tiveram sua expressão gênica afetada pela privação de sono paradoxal nas diversas áreas cerebrais estudadas. Entretanto, tiveram sua expressão alterada no grupo rebote (D’Almeida et al., 2005). É importante ressaltar que nesse trabalho, foi utilizada a técnica de autorradiografia, que permitiu que fossem avaliadas regiões cerebrais menores e mais específicas, enquanto nós fizemos as avaliações de forma mais generalizada ao utilizar homogenatos de córtex frontal e hipocampo inteiros. No presente trabalho, verificamos que os níveis e expressão relativa do Hcrtr1 no córtex frontal são diminuídos na PS em relação ao CT apenas em ZT0 (final da fase ativa), quando a atividade neuronal da orexina é máxima.
Durante a privação de sono prolongada ocorre a dessensibilização dos receptores de neurotransmissores em um processo adaptativo que regula seu número e função e restabelece a excitabilidade. A perda de sono pode assim levar ao enfraquecimento funcional dos receptores de neurotransmissores envolvidos na manutenção da vigília com consequências à sua estabilidade (ver revisão, Longordo
et al., 2009). Dessa forma, a diminuição na expressão do Hcrtr1 nos animais PS pode
ter ocorrido por um mecanismo adaptativo tendo em vista que a atividade orexinérgica é geralmente mais elevada em ZT0, em uma tentativa de contrabalancear a excitabilidade.
O córtex pré frontal é uma região particularmente sensível ao sono. Durante o sono não paradoxal, sua atividade tem a mais alta voltagem e as ondas mais lentas dentre as regiões corticais e a privação de sono altera as funções do córtex pré-frontal (ver revisão, Muzur et al., 2002). Talvez por esse motivo, tenhamos observado diferenças na expressão dos receptores tanto de MCH quanto de orexina apenas no córtex frontal e não no hipocampo, que por sua vez, tem sua função mais relacionada a processos de consolidação de memória que ocorrem durante o sono paradoxal (Lu
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6.3 Efeitos da privação de sono paradoxal sobre a ritmicidade dos genes