Chapitre VI: Conclusions
VI-1 Considérations méthodologiques
L’hybridation in situ fluorescente est à l’heure actuelle la seule technique qui permette à la fois l’identification taxinomique et le dénombrement des organismes picoeucaryotiques dans l’environnement. Cette technique de biologie moléculaire qui s’applique sur des cellules entières ne nécessite pas d’étapes d’extraction de matériel génétique et est particulièrement facile à mettre en œuvre. En effet cette méthode ne demande pas d’investissements matériels lourds et l’on obtient un résultat après une journée d’expérimentation. Ces aspects pratiques nous ont permis de réaliser des hybridations in situ à bord du navire océanographique sur lequel nous avons effectué les prélèvements dans l’océan Indien. Ces différents aspects pratiques sont d’une grande importance pour l’application efficace d’une technique d’analyse en océanographie. Cependant cette technique comporte également des limites clairement identifiées qu’il convient d’avoir en mémoire lors de l’analyse des données (Amann & Ludwig 2000). Plusieurs pistes doivent être explorées pour repousser ces limites.
VI-1-A Limites
La qualité des résultats quantitatifs issus de l'utilisation d'une sonde oligonucléotidique dépend, en premier lieu, de la qualité des bases de données qui sont utilisées pour le choix des signatures phylogénétiques du groupe cible. Plus une base de données couvre la diversité phylogénétique du groupe cible et des groupes qui lui sont proches, plus celle-ci est de bonne qualité et plus le choix des sondes pourra être fait avec confiance. Cependant même si une séquence est strictement spécifique in silico, il est absolument nécessaire de tester sur des espèces en culture les sondes nouvellement dessinées, notamment pour vérifier leur pénétration dans les cellules et ce particulièrement avec la méthode TSA-FISH qui nécessite la pénétration d’une enzyme de taille importante (40 000 daltons). La dépendance de l’intensité de fluorescence en fonction de l’état physiologique de l’organisme recherché, constitue une autre source de limitation. Cette intensité est directement corrélée au nombre de ribosomes, et donc de sites de fixation disponibles pour les sondes dans la cellule. Toutefois, l’utilisation d’un système d’amplification de la fluorescence, tel que le TSA, permet de s’affranchir en grande partie de ce biais. Ainsi nous avons pu montrer que des cellules
-Chapitre VI: Conclusions prélevées en phase plateau de la courbe de croissance, présentent des niveaux de fluorescence acceptables et peuvent être détectées en milieu naturel.
L’application massive de cette méthode dans le domaine de l’océanographie biologique souffre actuellement du manque d’automatisation du protocole expérimental, que ce soit au niveau de l’hybridation en elle même ou de l'acquisition puis de l’analyse des résultats. Des travaux sont actuellement en cours dans plusieurs laboratoires et entreprises pour essayer de s’affranchir de ces limitations techniques.
VI-1-B Perspectives d’automatisation de la méthode
Une automatisation partielle du protocole d’hybridation in situ est actuellement commercialisée par la société TECAN (http://www.tecan.com). Cependant ce protocole est développé pour des hybridations sur des tissus et de nombreuses adaptations sont nécessaires à son application sur des micro-organismes issus du milieu naturel. Cependant pour augmenter les capacités d’application du FISH sur le milieu naturel il est critique d'améliorer la capacité et la vitesse d'acquisition des données. Pour ce qui est des hybridations réalisées sur filtre, le facteur limitant se situe au niveau de la détection et du comptage des cellules hybridées, fastidieux et dépendant de l’observateur. La société CHEMUNEX (http://www.chemunex.com), en partenariat avec le laboratoire du Pr P. Lebaron (Banyuls-sur-Mer), a développé un système de cytomètrie en phase solide (CHEMSCAN) qui permet la détection de la fluorescence et le dénombrement des événements fluorescents sur filtres. Ce système qui a d'ores et déjà trouvé des applications en microbiologie (Pougnard et al. 2002), (Broadaway et al. 2003) nécessite certaines conditions (ex : absence totale de bruit de fond sur le filtre) qui rendent son application délicate lorsque l’on utilise la méthode TSA-FISH pour la détection des cellules.
Une autre voie, permettant d’augmenter les capacités d’analyses de la diversité des micro-organismes en milieu naturel, est la combinaison de l’hybridation in situ en milieu liquide et de la cytomètrie en flux. Cette association s’est révélée très efficace et a été employée pour les communautés bactériennes (Wallner et al. 1993, Veal et al. 2000). Cependant l'utilisation de sondes mono-marquées ne permettant pas l'obtention d'un signal fluorescent suffisamment élevé pour passer outre le bruit de fond provoqué par le milieu naturel, et l'autofluorescence naturelle de la chlorophylle contenue dans les cellules, cette association s’est avérée inadaptée à l’étude des picoeucaryotes dans l'environnement (Simon et al. 1995). L’application récente du TSA-FISH aux picoeucaryotes a ouvert de nouvelles
-Chapitre VI: Conclusions voies et a permis le développement d’une méthode combinant le TSA-FISH et la cytomètrie en flux pour l’étude des communautés de picoeucaryotes (Biegala et al. 2003) (voir Annexe I). Cette technique qui permet également l'accès à des informations sur la taille ou le cycle cellulaire des cellules hybridées, est particulièrement adaptée à l’étude en routine des communautés naturelles dont on connaît la composition taxinomique. En revanche, le TSA-FISH sur filtre est bien plus simple à mettre en œuvre et permet l'observation des cellules par microscopie, ce qui est préférable lorsque l'on s'intéresse à des communautés inconnues.
VI-1-C Développements méthodologiques récents pour l'analyse de la diversité à grande échelle
D’autres techniques de biologie moléculaire sont actuellement en cours de développement pour l’étude de la diversité des picoeucaryotes. Bien que celles-ci permettent des analyses taxinomiques et quantitatives plus massives, aucune ne permet une quantification précise (i.e. un nombre de cellule par millilitre). Parmi ces techniques, on peut citer la PCR quantitative qui, appliquée à des échantillons de Méditerranée avec des sondes ciblant les Prasinophyceae, donne de bons résultats (Zhu et al. en préparation) mais où l’on retrouve les biais d'extractions de l'ADN et de PCR évoqués en introduction de cette thèse. Une autre technique, consiste en l’utilisation de puces à ADN sur lesquelles est immobilisé tout un jeu de sondes et sur lesquelles on applique un extrait d’ADN environnemental. Cette technique a fait l’objet de développements méthodologiques au cours du programme européen PICODIV. Les étapes de PCR nécessaires à l'amplification de l'ADN environnemental ont montrés l'introduction de biais dans la spécificité des signaux obtenus. De plus, des travaux de mises au point au niveau de la spécificité des sondes et de l'intensité du signal obtenu doivent être réalisés avant de pouvoir appliquer cette technique dans le milieu naturel (Kerkmann & Medlin en préparation).
VI-2 Perspectives écologiques
L'un des problèmes les plus important en écologie microbienne est d’arriver à quantifier efficacement et de façon spécifique les composants d’une communauté dans le milieu naturel. L’obtention de telles données constitue le point de départ de toute étude