Nous avons au cours de cette thèse, développé deux axes d’étude complémentaires visant à une meilleure compréhension des mécanismes de biosynthèse des chaînes glycosaminoglycaniques des PGs et de leur mode de régulation.
Notre travail a consisté d’une part en une caractérisation fonctionnelle et structurale de la
β4GalT7, impliquée de façon précoce dans les voies de biosynthèse des GAGs. Cette enzyme catalyse le transfert du premier résidu Gal sur le Xyl relié à la protéine « core », étape nécessaire à la formation de l’amorce tétrasaccharidique et est indispensable à la polymérisation ultérieure des deux principaux types de chaînes de GAGs (Hep/HS et CS/DS). Pour ce faire, nous avons mis au point un système d’expression hétérologue dans des cellules eucaryotes, généré des mutants de la β 4GalT7 par mutagenèse dirigée, déterminé les paramètres cinétiques in vitro de l’enzyme sauvage et des mutants et mené des études ex vivo afin de mesurer les conséquences fonctionnelles des mutations introduites sur une lignée cellulaire déficiente en β4GalT7. Ces travaux ont été réalisés avec l’appui d’un modèle moléculaire de la structure 3D de la β4GalT7, établi à partir de celle de la β4GalT1 bovine et d’une analyse phylogénétique de 33 séquences codant les gènes des β4GalTs. Dans un premier temps, l’analyse des propriétés cinétiques d’une série de mutants a permis d’identifier, au sein de deux domaines conservés, les acides aminés potentiellement impliqués dans la reconnaissance du substrats donneur et accepteur. Notre travail a permis de mettre en évidence le rôle des résidus D163 et D165 du motif DXD dans la fixation de l’UDP-Gal via la liaison du Mn2+ et de façon intéressante, l’importance majeure du Trp224 dans les interactions avec les substrats donneur et accepteur. Nos résultats appuient l’hypothèse selon laquelle le résidu E227 pourrait potentiellement jouer le rôle de base catalytique lors du mécanisme réactionnel de la β4GalT7.
Dans un second temps, nous nous sommes particulièrement intéressés aux conséquences fonctionnelles des mutations de la β4GalT7 sur la biosynthèse des PGs. Nous avons mis en œuvre des modèles d’étude ex vivo, dans les cellules eucaryotes recombinantes, des conséquences fonctionnelles des mutations introduites sur le taux de biosynthèse des GAGs. Nous nous sommes également attachés à l’étude de l’initiation de l’amorce tétrasaccharidique à partir d’un PG modèle ou d’un xyloside exogène. L’ensemble des données fournies par les études in vitro et ex vivo ont permis de mieux cerner le rôle des résidus impliqués dans l’organisation du site de fixation des substrats donneur et accepteur et/ou la catalyse
enzymatique de la β4GalT7. Ces informations apportent des bases rationnelles en vue du développement de composés chimiques ou de glycomimétiques à visée pharmacologique capables de contribuer à la restauration de la MEC endommagée (lors des atteintes dégénératives du cartilage), ou de manière plus générale, dans le traitement de pathologies liées à une perturbation du métabolisme des PGs. La β4GalT7 représente en effet une cible thérapeutique de choix par sa capacité de prendre en charge des composés mimant l’amorce glycopeptidique.
Dans le but d’accéder à une meilleure compréhension des bases moléculaires qui régissent les modalités nécessaires à la reconnaissance des substrats donneur et accepteur, nous souhaitons approfondir ces travaux par des études de résonnance plasmonique de surface et des analyses structurales par radiocrystallographie. Des expériences de purification de la β4GalT7 fusionnée à la protéine GST dans un système d’expression hétérologue bactérien sont en cours de réalisation dans notre équipe afin de poursuivre les travaux entrepris.
Dans une partie complémentaire de notre travail, nous nous sommes intéressés aux phénomènes responsables de la régulation de l’expression des enzymes participant à la biosynthèse des GAGs en étudiant la possibilité de l’implication de la méthylation de l’ADN comme élément de régulation. Nous avons étudié en premier lieu un modèle de lignée invasive du tissu conjonctif, la lignée de chondrosarcome humain HEMC et réalisé la cartographie de méthylation des régions promotrices des gènes codant les enzymes responsables de la synthèse et des modifications des chaînes de HS. Dans cette étude, nous avons montré pour la première fois qu’une famille spécifique de HS-O-sulfotransférases (les 3-OSTs) présente une hyperméthylation des îlots CpG situés au niveau de la région proximale des gènes conduisant à une diminution d’expression des transcrits correspondants, dans les cellules HEMC.
Les conséquences néfastes des diminutions d’expression des gènes hyperméthylés sur le comportement des cellules cancéreuses HEMC ont pu être corrigées par traitement des cellules avec un inhibiteur des DNMTs, la 5-Aza-dc. L’analyse de l’impact de la surexpression des STs 3-OST1 et 3OST-3A a permis d’attribuer de manière spécifique une contribution de la 3-O-sulfatation au phénotype de cette lignée cancéreuse. En effet, nos travaux suggèrent que la baisse de sulfatation des PGs à HS cellulaires (en position 3 des GlcNS) affecte le comportement cellulaire et contribue à l’altération de phénotype cellulaire et des caractéristiques invasives des cellules de chondrosarcome humain HEMC.
Des travaux ont été initiés afin d’établir le rôle de cette modification dans d’autres lignées cancéreuses (chondrosarcome SW 1353, MCF7). Nous souhaitons à court terme mesurer les effets de la répression de ces gènes dans les lignées tumorales et mieux cerner l’impact potentiel de la 3-O-sulfatation dans d’autres types de tumeurs. De plus, d’autres mécanismes de régulation épigénétique notamment les modifications touchant les histones, n’ont pas été abordés dans cette étude. Il serait intéressant de voir si le traitement des cellules par un inhibiteur des HDACs, la trichostatine A, potentialiserait les effets cellulaires obtenus par la déméthylation des gènes. Par ailleurs, l’influence de la 3-O-sulfatation des HS membranaires sur la régulation des facteurs de croissance est une piste à creuser. Nous souhaiterions également réaliser des analyses plus poussées de la composition disaccharidique des HS par la technique RPIP-HPLC (Reversed-phase ion-pairing-High Performance Liquid Chromatography) ou par spectrométrie de masse afin de définir les spécificités de substrat des différentes STs et les effets cellulaires associés aux caractéristiques structurales des motifs disaccharidiques des chaînes de GAGs. Enfin, nous nous sommes focalisés, dans le cadre de cette thèse, aux enzymes de biosynthèse des HS. De plus, l’étude du rôle potentiel de modifications épigénétiques des voies de biosynthèse des CS dans le processus de cancérogenèse est certainement une hypothèse très intéressante à envisager.
Du fait de leur caractère réversible, l’usage d’agents inhibiteurs des DNMTs s’est révélé efficace dans le traitement d’hémopathies malignes et est employé pour traiter les tumeurs solides. Les chondrosarcomes restent des cancers difficiles à diagnostiquer et à traiter car ces tumeurs sont résistantes aux thérapies conventionnelles. Ces résultats ouvrent des perspectives prometteuses dans la découverte et la compréhension de nouveaux mécanismes cellulaires basés sur la reconnaissance de certains motifs portés par les HS présents à la surface des cellules tumorales et qui concourent au processus de cancérogenèse.