Conclusions et perspectives

Mon travail de thèse avait pour objectifs d’étudier la pathogénicité des parasites du genre Cryptosporidium et de mettre en évidence une association entre le développement d’un cancer colique chez l’Homme et l’infection par le parasite. Pour cela, un nouveau modèle de culture 3D in vitro de C. parvum a été mis au point basé sur des explants entériques murins et un dispositif microfluidique a été adapté à ce modèle dans le but de l’optimiser. Les différentes conclusions de ce travail sont les suivantes :

1 Une étude de l’association entre la présence de Cryptosporidium et la présence de néoplasies digestives a montré une prévalence significativement plus importante du parasite chez des patients libanais atteints de néoplasies digestives et plus particulièrement coliques. C. parvum et C. hominis ont été associés aux lésions néoplasiques avec une prédominance de C. hominis. Il s’agit de la première description suggérant une association entre C. hominis et le développement de cancers coliques.

2 Ce travail a permis la mise en place d’un système de culture 3D se basant sur des explants entériques de souris SCID-D. La confirmation de la viabilité de l’explant a été validée par la vérification de l’architecture histologique du tissu, de la prolifération cellulaire et de l’absence de cytotoxicité cellulaire. Il s’agit du premier modèle de culture 3D basé sur des explants entériques qui ont pu être maintenus viables pendant au moins 35 jours.

3 L’infection de l’explant au bout de 8 jours de culture par deux doses de C. parvum a été possible. La présence de l’infection a été confirmée par observation microscopique, approche moléculaire et immunofluorescence. L’infection par faible dose a permis une multiplication plus efficace du parasite. Il s’agit de la première description d’un modèle d’infection par C. parvum basé sur des explants entériques et dont l’infection a été maintenue au moins 4 semaines.

4 L’analyse histologique des explants infectés par C. parvum nous a permis de confirmer le développement de néoplasies intra-épithéliales de bas grade 27 jours après infection. Ce modèle constitue le premier modèle de culture 3D permettant de développer une néoplasie de bas grade après infection parasitaire.

5 Nos données chez l’homme et in vitro viennent à nouveau confirmer l’association de l’infection à Cryptosporidium au développement de cancers digestifs précédemment décrite dans le laboratoire en modèle animal.

6 Ce travail a permis la conception et la fabrication d’un dispositif microfluidique pour la culture d’explant entérique de souris SCID-D. Ce dispositif a été fabriqué à partir de PDMS et d’une membrane millipore. Il est aliméntée par un système de pompes sous pressions mettant le milieu de culture sous pression. Le dispositif assurant un renouvellement continu et automatisé du milieu de culture, a maintenu l’explant vivant pendant 8 jours (durée de suivi). Il s’agit alors du premier dispositif microfluidique adapté à la culture d’explant entérique permettant une viabilité de 8 jours.

7 Cette approche de culture d’explant infecté par le parasite représente une avancée majeure non seulement dans l’étude de la cryptosporidiose ou des adénocarcinomes induits par des parasites, mais aussi, de manière plus générale, dans l’étude des pathologies affectant l’intestin. La culture d’explant sera ainsi une solution intermédiaire entre la culture cellulaire 2D basée sur des lignées immortalisées et l’approche exclusivement in vivo éthiquement remise en cause. Cette voie technique réduira le nombre d’animaux nécessaires aux expériences tout en maintenant une expérimentation dans un modèle 3D.

Dans le but de compléter ce travail de thèse, plusieurs voies d’explorations biologiques ou microfluidiques peuvent être emprintées à court et moyen terme :

 Détermination dans d’autres zones géographiques de l’implication potentielle de Cryptosporidium dans l’induction des cancers digestifs. Ainsi, une étude épidémiologique intégrant plusieurs hôpitaux au Sénégal est en train d’être mise en place par le laboratoire EcoPhY en collaboration avec Gilles Riveau (Centre de Recherche Biomédicale Espoir Pour La Santé CRB-EPLS, Sénégal et IPL). Cette étude épidémiologique a pour but de collecter les données cliniques des patients intégrés dans l’étude via un questionnaire standardisé. Une attention particulière sera aussi portée aux patients atteints d’un cancer des voies biliaires. Le statut immunitaire des patients sélectionnés sera aussi pris en compte. En parallèle, la détection et la caractérisation moléculaire du parasite sera réalisée sur différentes cohortes d’intérêt.

 Concernant la culture 3D infectée par le parasite, le milieu de culture récupéré lors de la culture de l’explant infecté par Cryptosporidium pourrait être utilisé pour infecter l’animal ou d’autres explants. Cette étape permettra de confirmer que le parasite a pu

réaliser son cycle de reproduction complet avec une production de nouveaux oocystes infectieux.

 La mise en place d’un système de culture 3D utilisant des explants de souris immunocompétentes pourrait aider à comprendre si la durée de vie de l’explant est due à l’état d’immunodépression de la souris ou au système de culture lui-même.

 La création d’un gradient chimique de facteur de croissance par administration temporelle de ce dernier présent dans le milieu de culture permettrait de tester la durée du maintien de la croissance cellulaire normale de l’explant.

 Ce modèle d’explant 3D infecté par le parasite pourrait être utilisé comme outil pour l’identification de voies de signalisation potentiellement impliquées dans la transformation de la cellule hôte par des approches de transcriptomique, protéomique ou épigénétique déjà développées dans l’équipe BDPEE.

 Concernant le dispositif microfluidique, l’objectif final serait de pouvoir l’adapter à la culture de Cryptosporidium sur explant entérique. Ce nouveau dispositif d’analyse, sur une base technologique s’appuyant sur les microsystèmes électroniques, permettrait de suivre le développement de tumeurs dans des explants d’intestin murins mis en culture et infectés par C. parvum. Le développement de cet outil de mesure, représentera un nouveau support technologique d’étude des cancers colorectaux. Afin de pouvoir l’optimiser, différentes pistes pourraient être envisagées :

o Utilisation d’une pompe d’aspiration pour assurer le flux à l’intérieur du dispositif microfluidique sans risque de changement de pH.

o Traitement de la surface du PDMS et modification de cette surface PDMS par un traitement tensioactif par exemple afin d’inhiber au maximum les effets toxiques du PDMS sur la culture de tissus.