Les études en protéomique s’intéressent aux fonctions ainsi qu’à l’identification des protéines. Ce projet proposé une méthode semi-préparatrice utilisant la CE à plusieurs dimensions en parallèle et s’inscrit dans les efforts pour identifier des protéines autant par l’analyse des protéines («top-down») que par l’analyse des peptides («bottom up») obtenues lors de digestion protéiques. La stratégie présentée consiste donc à simplifier un mélange de protéines en plusieurs fractions, ou sous-échantillons moins complexe, pour permettre l’identification de celles-ci en exploitant la redondance d’une protéine dans plus d’une fraction. Pour cela, il fallait commencer par démontrer qu’il était possible de séparer des protéines de façon reproductible pour permettre plusieurs collectes consécutives. Aussi, il était nécessaire de prouver qu’il était possible de collecter suffisamment de protéines pour les traités par cartographie peptidique ou protéique. Ensuite, il fallait les traiter par cartographie peptidique et/ou protéique. Finalement, il fallait tenter de présenter plusieurs dimensions en parallèle et ainsi démontrer l’exploitabilité de la redondance d’une protéine dans des fractions différentes.
Tout d’abord, l’étude du revêtement de DDAB sans régénération a montré que le manque de répétabilité est attribuable à la dégradation du revêtement donc que la régénération du revêtement est nécessaire entre chaque injection. Les résultats des études de régénération du revêtement entre chaque injection ont démontrés une bonne répétabilité de la séparation d’un mélange protéique à dix reprises lorsque le volume de sortie est de 100 µL. Cependant, il n’a pas été possible de vérifier la collecte de fractions parce les protéines n’ont pas été observées dans les fractions collectées ni pas CE-UV, ni par LC- MS. En d’autres termes, il semblait que les concentrations de protéines collectées étaient plus basses que les limites de détections du CE-UV et du LC-MS. Il serait donc envisageable d‘explorer des techniques de préconcentration pour augmenter la concentration finale des protéines collectées, comme l’utilisation de l’enrichissement par extraction sur phase solide («Zip-tip») ou par évaporation du solvant sous vide. Cette dernière risque de donner une solution avec une concentration de sels de tampons, l’acétate de lithium et le DDAB dans les études avec le revêtement, trop concentrée.
Aussi, l’utilisation d’un capillaire de 100 µm serait intéressante pour augmenter la masse de protéine injectée comme fait par Lucy et al. [12].
La LC-MS est reconnue pour être une technique très sensible, donc la possibilité qu’il y ait suppression du signal des protéines lors de l’ionisation dans l’ESI-MS est à considérer. En effet, un signal très important provenant du DDA+ était observé. Il serait donc intéressant soit d’utiliser l’ultrafiltration avec une membrane de porosité appropriée pour enlever les traces de DDAB, soit d’optimiser les conditions chromatographiques qui pourraient mieux séparer le DDA+ des protéines en LC-MS, soit d’optimiser le revêtement pour qu’il ne détache pas de la paroi durant les séparations CE.
Puisque les essais avec le revêtement DDAB ne permettaient d’observer les protéines ni par CE-UV ni par LC-MS, donc ni de tracer une carte protéique, la LIF fut introduite comme méthode de détection. Aussi, il semblait intéressant de ne pas utiliser de revêtement DDAB simplement pour démontrer la possibilité de tracer la carte protéique ainsi que la carte peptidique de l’alb-FITC. Ceci permettait d’étudier l’approche sans ajouter un contaminant qui pourrait influencer la digestion de la protéine ou l’analyse par LC-MS. La collecte de fraction par CE-LIF a servi à démontrer que le facteur de dilution se situait autour de 308. Les temps de migration de l’alb-FITC permettaient de se demander si l’utilisation d’un revêtement était vraiment nécessaire puisqu’il présentait une précision pour le temps de migration acceptable. Cependant, la précision (les valeurs de RSD) de la hauteur et l’aire des pics avec DDAB versus sans revêtement permettent d’affirmer qu’il semble profitable d’utiliser un revêtement pour être quantitatif. Puisqu’un pic de protéine a été détecté par CE-LIF après la collecte, il serait intéressant de tenter une séparation d’un mélange de protéines fluorescentes à différentes conditions de BGE afin de poursuivre les séparations CE semi-préparatrices à plusieurs dimensions. Les cartes peptidiques de l’alb-FITC collectée issues de la digestion de la protéine par la CT libre et CT-GA ont pu être tracées. Les électrophérogrammes semblaient représenter des digestions partielles de la protéine alb-FITC, et donc l’espoir que le système proposé pourrait marcher.
Étant donné les conclusions exposées précédemment, il serait intéressant d’utiliser la CE-LIF avec le revêtement de DDAB pour un mélange plus complexe puisque les limites de détections sont plus basses pour ce mode de détection et que le DDAB est «invisible» avec cette méthode de détection. Par contre, il faudrait vérifier que la présence de DDAB n’empêcherait pas la digestion enzymatique. Aussi, puisque les analyses ont démontré que le revêtement s’écoulait après chaque injection, il serait intéressant d’essayer de travailler avec un revêtement permanent pour conserver la méthode de détection par CE-UV.
Finalement, pour poursuivre les travaux, une stratégie complète qui inclurait plusieurs conditions de BGE démontrerait la faisabilité de l’approche proposée. Par exemple, une première collecte de fraction effectuée à de bas pH (plus petit que 2) de mélange standard de protéines. Puis, la collecte de fraction par un revêtement comme le DDAB, c’est-à-dire semi permanent et réversible, pourrait être effectué. Pour diminuer la dégradation du revêtement, un sel zwittérionique en forte concentration pourrait augmenter la force ionique du milieu et ainsi augmenter la stabilité de ce revêtement. Une vérification de son interférence lors de la digestion serait important, évidemment. Pour finir ce processus de fractionnement, la séparation de ce même mélange à haut pH pourrait compléter la gamme de séparation. Ensuite, chaque collecte pourrait être analysée par cartographie peptidique ou protéique pour tenter d’en identifier les composantes et exploiter la redondance d’une protéine donnée.