Conclusion

Como auxiliares da determinação estrutural de compostos podem-se usar métodos degradativos. As hidrólises químicas facilitam a identificação de compostos complexos, particularmente ao permitir a separação das geninas de açúcares e de grupos acilo. Para estudar os heterósidos flavonoídicos acilados pode proceder-se a 3 tipos de hidrólise diferentes: hidrólise ácida, hidrólise alcalina e hidrólise enzimática (186). A hidrólise ácida destina-se à ruptura de ligações hemiacetálicas. É um processo que permite distinguir O- de C-heterósidos pela resistência destes últimos à hidrólise. Neste processo obtêm-se as geninas e os açúcares. As geninas podem ser posteriormente identificadas por HPLC-DAD ou HPLC-MS. O tempo necessário para a separação da parte glicosídica de um O-glicosilflavonóide é determinado pela concentração do ácido, pela natureza do açúcar e pela posição deste no flavonóide. Assim, relativamente à natureza do açúcar, o tempo necessário para a separação dos exemplos seguintes é: ácido glucurónico > glucose = galactose > ramnose; de acordo com a posição do açúcar será: 7-O-gli ósi os > 4’-O-glicósidos > 3-O-glicósidos (86, 185).

A hidrólise alcalina é tipicamente usada em compostos acilados. Neste processo corre a quebra de ligações éster, estabelecidas entre um ácido alifático ou aromático e um hidroxilo fenólico de uma genina ou um hidroxilo de um açúcar. Após a hidrólise alcalina de heterósidos flavonoídicos acilados com ácidos hidroxicinâmicos verifica-se o aparecimento dos ácidos hidroxicinâmicos e heterósidos flavonoídicos e o desaparecimento dos derivados acilados. Por vezes o extracto saponificado é usado em HPLC-MS para identificar os heterósidos desacilados. Esta operação permite, por exemplo, distinguir os grupos substituintes glicosilo e cafeoilo que apresentam a mesma perda de massa (-162 u) (11).

A hidrólise enzimática é um método útil para estabelecer a natureza da ligação do açúcar à genina ( ou ). Contudo, açúcares acilados e C-glicósidos são resistentes à hidrólise enzimática (86, 185).

Introdução

54

2.5.2. Compostos voláteis

Tal como referido anteriormente os compostos voláteis constituem uma das primeiras defesas das plantas aquando do ataque dos insectos. O perfil volátil de uma planta abrange um largo espectro de compostos com diferentes características, normalmente com um baixo peso molecular, podendo ter origens biossintéticas bastantes distintas. Face à grande variedade de compostos é necessário recorrer a técnicas de separação e de identificação bastante sensíveis.

A cromatografia gasosa (GC) acoplada a espectrometria de massa combina duas poderosas técnicas: a primeira permite a separação dos compostos e a segunda a sua detecção e quantificação. Esta combinação tornou-se rapidamente a metodologia mais usada e efectiva no estudo destes compostos (2).

Vários processos extractivos podem ser usados. Na sua escolha deve-se ter em conta aquele que permite obter um perfil mais fidedigno e representativo da matriz em estudo. Nos estudos da interacção insecto-planta deve-se atender a factores adicionais que visam tentar mimetizar as condições que ocorrem na Natureza e evitar ao máximo provocar stress ao insecto.

Estes aspectos serão abordados mais aprofundadamente nas secções que se seguem.

2.5.2.1. Extracção

Várias técnicas de extracção têm sido desenvolvidas para a análise do perfil de compostos voláteis de matrizes naturais. As metodologias tradicionais (destilação, extracção com solventes e Soxhlet e extracção em fase sólida) geralmente implicam vários passos, incluindo a purificação e concentração do extracto (com consequente perda de analito), longos tempos de preparação e utilização de grandes quantidades de solventes orgânicos (197).

Pawlisyn (198) desenvolveu uma técnica de adsorção denominada de microextracção em fase sólida (SPME), considerada como melhoria e substituto dos métodos clássicos de preparação da amostra (199). A SPME é uma técnica de preparação da amostra bem estabelecida para a análise de compostos voláteis e semi- voláteis, apresentando muitas vantagens, entre elas a alta sensibilidade e reprodutibilidade, o facto de ser uma técnica simples, de não envolver solventes, o reduzido custo que apresenta e a combinação de extração e pré-concentração numa única etapa (200).

Introdução

55

Esta técnica, baseada em mecanismos de absorção e/ou adsorção, pode ser realizada em três modos diferentes: injecção directa (imersão), extracção no espaço de cabeça (Headspace - HS) e extracção com protecção de membrana (197).

O HS-SPME é o modo mais utilizado por várias razões, sendo a principal a falta de contacto com a amostra, o que reduz a influência da matriz e impede a decomposição ou contaminação do revestimento da fibra (201). Além disso, o tempo necessário para atingir o equilíbrio entre o analito na fase gasosa da amostra e a fase estacionária é menor do que para amostras aquosas, sendo por estas razões recomendado para compostos com alta volatilidade (197). Vários revestimentos estão disponíveis, sendo que a sua escolha deve ter em conta a estrutura química dos compostos alvo.

A selecção cuidadosa da polaridade e da espessura do revestimento permite a extracção de compostos diferentes; no entanto, há outras variáveis igualmente importantes a ter em conta, nomeadamente a agitação, a temperatura, o pH que muitas vezes se faz para ajudar a libertação de alguns compostos (199).

No estudo de sistemas biológicos, como, por exemplo, o sistema insecto-planta, a SPME constitui uma das técnicas de eleição. O HS-SPME é a técnica mais usada pelo facto de não existir contacto entre a amostra e a fibra, tornando possível a análise de amostras in vivo, como aconteceu nos trabalhos desenvolvidos nesta tese. Para a detecção destes compostos em sistemas vivos, as questões técnicas devem ser cuidadosamente controladas, tendo sempre como objectivo primordial minimizar os níveis de stress dos organismos, reduzindo assim a interferência desse factor nos resultados (202), como foi já dito.