1-4 Conclusion

Phase stationnaire Silice greffée C8 ou C18 T T T Chaînes alkyle Queue hydrophobe de la téicoplanine

Pallier qui indique la fin du remplissage

Absorbance

Figure 46 : Représentation du suivi de l’immobilisation de la teicoplanine.

Dans cette étude, nous avons analysé le rôle des unités saccharidiques sur les

propriétés de la reconnaissance chirale de la teicoplanine. Ces groupements agissent de

manière négative sur l'énantiosélectivité apparente via deux régions distinctes de fixation, la

poche fortement énantiosélective (la cavité spécifique pour l'acide aminé) et quelques régions

de fixation à faible affinité. Les effets sur la cavité de fixation à forte affinité proviennent des

changements de la constante d'adsorption des énantiomères et de l'accessibilité au site.

Une autre analyse basée sur les variations des paramètres enthalpiques et entropiques

nous a permis de montrer que la diminution de l'accessibilité au site dépend des groupements

saccharidiques qui sont responsables d’un processus de déshydratation moins efficace, ce qui

entraîne la perte de quelques contacts de discrimination chirale avec la cavité.

VII-2 Développement d’une PSC de type teicoplanine

immobilisée d’une manière non-covalente sur des

Après avoir utilisé dans le chapitre précédent, une PSC teicoplanine commerciale

(immobilisée classiquement d’une manière covalente sur gel de silice) pour la séparation

chirale du tryptophane et après avoir étudié le mécanisme de reconnaissance chirale sur ce

type de sélecteur glycopeptidique, nous nous sommes intéressés dans ce deuxième chapitre, à

étudier l’influence du mode d’immobilisation de la teicoplanine sur la séparation d’acides

aminés.

L’immobilisation non covalente de ligands à caractère hydrophobe sur des surfaces

chromatographiques apolaires a été largement exploitée en CLHP, notamment pour la

séparation des espèces ionisées par chromatographie d’échange d’ions [306] ou l'étude des

interactions entre des composés bioactifs et des systèmes de type "membrane-like" [307].

Une telle approche a été également utilisée pour la séparation chirale en CLHP. Des

études précédentes ont montré que les supports chromatographiques de type C

ou carbone

graphite poreux, sur lesquels des sélecteurs chiraux étaient adsorbés dynamiquement,

pouvaient être employés avec succès en tant que PSCs. Des dérivés apolaires d'acides aminés,

de tartaramide, de lasalocide ou d'acylcarnitine ont été immobilisés par cette méthode et

utilisés ensuite avec succès pour la résolution de diverses espèces racémiques [308 - 312].

La teicoplanine (cf. section V-1-3), se distingue des autres sélecteurs chiraux

glycopeptidiques par le fait qu'elle possède une chaîne hydrophobe latérale acylée C

attachée au groupement glucopyranosyl. On s'attend donc à ce qu'une telle partie hydrophobe

puisse être utilisée pour immobiliser ce sélecteur chiral sur des supports chromatographiques

apolaires pour créer un nouveau type de PSC.

Deux supports chromatographiques de type C

et C

sont utilisés, dans ce chapitre,

pour immobiliser la teicoplanine via l’adsorption dynamique. La rétention et les propriétés

énantiosélectives ainsi que la stabilité dans le temps de ces phases stationnaires seront étudiés

en utilisant une phase mobile aqueuse. Quelques acides aminés aromatiques seront utilisés

comme solutés tests.

VII-2-1 Matériel et méthodes :

VII-2-1-1 Appareillage :

L’appareillage utilisé ici est identique à celui décrit dans la section précédente. (λ =

260 nm pour détecter les composés injectés et 310 nm pour détecter l’élution de la

teicoplanine (plateau) lors de la procédure d’immobilisation).

Les colonnes de type C

(250 mm x 4.0 mm d.i) et C

(250 mm x 4.6 mm d.i) (taille

des particules : 5 μm, taille de pore : 100Å) sont fournies respectivement par Merck

(Darmstadt, Allemagne) et Macherey-Nagel (Duren, Allemagne). Ces colonnes sont utilisées

à une température (25

C) contrôlée par un four Igloocil (Interchim).

VII-2-1-2 Réactifs :

Tous les énantiomères sont obtenus chez Sigma Aldrich (Saint-Quentin, France) ou

Bachem (Weil am Rhein, Allemagne). Le phosphate de sodium monobasique et le phosphate

de sodium dibasique sont fournis par Sigma Aldrich. La teicoplanine est fournie par Astec

(Whippany, Etats-Unis). L’acétonitrile qualité CLHP est fourni par Fischer scientific

(Leicestershine, UK). L'eau est obtenue à partir d'un système de purification d'eau d'Elgastat

option (Odil, Talant, France) équipé d'une cartouche d'osmose inverse.

VII-2-1-3 Procédure d’immobilisation :

L'immobilisation du sélecteur chiral teicoplanine est effectuée in situ, sur les colonnes

de type C

et C

(Figure 45).

Une solution aqueuse de 1 mM de teicoplanine est utilisée comme phase mobile à un

débit de 0.1 mL/min à une température de 25

C jusqu'à l’obtention d’un plateau et d’une

réponse stable du détecteur à (λ = 310 nm) (Figure 46).

Avant les expériences chromatographiques, les colonnes sont équilibrées avec la phase

mobile aqueuse (tampon phosphate 5 mM; pH 7.0) jusqu'à l’observation d’une ligne de base

stable. La quantité de teicoplanine immobilisée sur les supports chromatographiques est

estimée en soustrayant l'absorbance UV de la solution de teicoplanine non fixée à celle de la

solution initiale, à 280 nm. Elle est estimée à environ 150 μmoles pour chacune des deux

colonnes. Quand les colonnes ne sont pas utilisées pendant une période prolongée, les

colonnes sont stockées sous tampon aqueux contenant de l'azide de sodium (0.05%) afin de

les protéger des contaminations microbiennes.

VII-2-1-4 Conditions chromatographiques :

- La phase mobile est composée de tampon phosphate (5 mM, pH 7.0). Le débit varie de 0.25