Conclusion et perspectives

Pour approfondir nos connaissances sur la dynamine OPA1/Msp1p, je me suis intéressée à sa caractérisation chez la levure S. pombe. Nous avons construit un mutant thermosensible de Msp1p, muté sur son domaine GTPase (P300S), qui est affecté dans son rôle fusogène. En effet, à température restrictive (37°C) les levures porteuses de la mutation P300S sur le gène msp1+ _{présentent un réseau mitochondrial fragmenté. Ces résultats seront} confirmés par une analyse de la capacité des mitochondries de la souche Msp1P300S à fusionner lors de la conjugaison. L’absence de létalité de ce mutant en milieu respiratoire montre que cette mutation n’induit pas la perte totale du génome mitochondrial comme dans le cas d’un mutant nul (Pelloquin et al, 1998). La mutation P300S de Msp1 inhiberait donc la fonction de la protéine dans la dynamique mitochondriale sans affecter son rôle dans la maintenance du génome mitochondrial. Ainsi, comme dans le cas de la surexpression du mutant de délétion du domaine TM1 et contrairement à la délétion du gène ou à l’expression des mutants des domaines GTPase, GED ou TM2, les deux fonctions de la dynamine seraient découplées.

Nous avons analysé les effets de la mutation P300S de Msp1p sur fonctionnement de la chaîne respiratoire en cultivant la souche mutée sur des milieux respiratoires ou

197 fermentescibles. Sur milieu glucose, la mutation P300S provoque un ralentissement de croissance à température restrictive. À l'image des mutants de respiration de la levure S. pombe qui présentent un déficit de croissance en milieu glucose, ce ralentissement de croissance pourrait être provoqué par un mauvais fonctionnement de la chaîne respiratoire. Cette hypothèse est renforcée par la mise en évidence d’une altération de la capacité de la souche Msp1P300S, porteuse de l’allèle ade6-M210, à oxyder l’intermédiaire de la voie de biosynthèse de l’adénine, AIR, quand elle est cultivée en milieu pauvre en adénine. Un défaut de fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale pourrait entraîner une diminution de la quantité d’ATP (ou de la capacité à re-oxyder les équivalent réduits) et provoquer ainsi un ralentissement de croissance. Rappelons que chez S. pombe l’effet Crabtree (répression de la respiration par le glucose) est moins prononcé que chez S. cerevisiae (Foury & Goffeau, 1972). L’élévation de la concentration en glucose à 10% pourrait, en augmentant la glycolyse, compenser le défaut de croissance de la souche msp1-P300S observé à 3% glucose.

L’hypothèse d’un défaut de respiration induit par la mutation P300S de Msp1p est en accord avec le retard de croissance observé quand cette souche est cultivée en milieu respiratoire (éthanol-glycérol) à température restrictive. De même, le taux de consommation d’oxygène mesuré par oxygraphie est significativement réduit après 24h de croissance à température restrictive dans ce milieu. Cette réduction de la respiration est tardive et postérieure à la fragmentation des mitochondries qui débute dès 15 min après la mise en culture à température restrictive et est totale après 60 min. Ce défaut de respiration semble donc une conséquence secondaire du défaut de morphologie des mitochondries, qui pourrait être lié à une déplétion en génome mitochondrial qu’il conviendra de caractériser. On pourrait également proposer qu’un défaut de structuration de la membrane interne induit par l’inactivation de Msp1p puisse à long terme en perturbant l’organisation de la chaîne respiratoire affecter son fonctionnement. L’inactivation de la dynamine humaine OPA1 provoque un défaut de respiration associé à une baisse de l’activité des complexes respiratoires I, III et IV dans les MEFs traitées par interférence à l’ARN (Chen et al, 2005), ainsi qu'une diminution plus ou moins sévère du nombre de nucléoïdes par mitochondrie dans les MEFs OPA1-/- _{(Chen et al, 2007).}

Les mutants de gènes nucléaires affectant la respiration chez S. pombe, incapables de pousser sur milieu éthanol/glycérol, sont également pour la plupart d'entre-eux déficients pour la croissance en milieu galactose (Chiron et al, 2007). Le mutant Msp1P300S qui ne montre qu’un retard de croissance en milieu éthanol/glycérol n’est pourtant pas capable de vivre à température restrictive sur milieu galactose. La sévérité du phénotype sur milieu

199 galactose, qui ségrège avec la mutation P300S comme l’ensemble des autres phénotypes associés, reste à ce jour inexpliquée. Une hypothèse proposée pour expliquer l’impossibilité d’utiliser le galactose en absence de phosphorylation oxydative est la faible efficacité de la voie d’entrée du galactose dans la glycolyse (voie de Leloir). La glycolyse serait alors limitée et ne produirait pas assez d’ATP pour assurer la croissance des cellules sans respiration. Dans la voie de Leloir, le galactose est tout d’abord phosphorylé par la galactokinase (Gal1p), puis un groupement uridyl est ajouté par la galactose-1-P uridyl transférase (Gal7p) et enfin l’UDP galactose-4’-épimérase (Gal10p) va permettre la transformation de l’UDP-galactose en UDP- glucose, le groupement uridyl retransmis au galactose et le glucose entre dans la voie glycolytique. Nous avons testé si la létalité du mutant Msp1P300S en milieu galactose pouvait être compensée par une augmentation de l’expression des enzymes de voie Leloir. Pour cela, des levures mutées pour le gène msp1+ _{ont été transformées par un plasmide portant un} fragment d’ADN génomique (chromosome II position 4482702 et 4492267) contenant les gènes gal1+_{, gal7}+ _{et gal10}+ _{(don de N. Bonnefoy), et leur croissance en milieu galactose a été} testée à température restrictive. Aucune complémentation n’a été observée; cependant le gène gal7+ _{présent dans ce fragment étant incomplet (absence des 113 premiers nucléotides du} cadre de lecture et de son promoteur) nous reproduirons ces expériences avec le cluster complet.

Le ralentissement de croissance de la souche exprimant Msp1P300S en milieu glucose et éthanol-glycérol, ainsi que la létalité en milieu galactose, sont compensés par l'addition de sorbitol, un sucre non métabolisable, dans le milieu de culture. Les levures pour palier une élévation d'osmolarité du milieu extracellulaire accumulent à l'intérieur de la cellule du glycérol afin de maintenir l’homéostasie osmotique (Clotet & Posas, 2007). Chez la levure, le glycérol est synthétisé à partir d'un intermédiaire de la glycolyse, le dihydroxyacetonephosphate, en deux étapes catalysées par une glycerophosphate dehydrogenase dépendante du NADH et une phosphatase (Flores et al, 2000). Chez S. pombe, comme chez S. cerevisiae, il existe deux glycerophosphates dehydrogenases NADH dépendantes dont une, Gpd1p, est induite en réponse à un stress osmotique (Aiba et al, 1995). L'expression du gène gpd1+ _{est contrôlée au niveau transcriptionnel par une voie de signalisation de type} MAPK impliquant les protéines Win/Wak (MAPKKK), Wis1 (MAPKK) et Sty1 (MAPK) (Gacto et al, 2003; Smith et al) (figure n°81). Nous pouvons proposer que la synthèse de glycérol induite par une élévation de l'osmolarité en augmentant la quantité de substrat disponible, ou en permettant la ré-oxydation du NADH, compenserait le défaut de respiration