CONCLUSION – PERSPECTIVES
Les résultats obtenus au cours de ma thèse amènent de nombreuses questions et ouvrent plusieurs axes de recherche. En ce qui concerne la suite des travaux sur GSK-3, il apparaît indispensable de préciser le rôle exact de la protéine PfGSK-3 dans les relations entre le parasite Plasmodium falciparum et le globule rouge de l’hôte, notamment dans le but d’évaluer l’intérêt de la recherche de nouvelles molécules à visée antipaludéenne ciblant cette protéine. Quant à l’orientation des travaux concernant Polo, il pourrait être intéressant, dans le cadre de la recherche en oncologie, d’effectuer un large criblage de molécules pouvant inhiber cette protéine et les protéines interagissant avec Polo afin d’identifier de nouvelles molécules à visée antimitotique.
I. GSK-3 de Plasmodium falciparum
La purification des protéines GSK-3 de différentes espèces par chromatographie d’affinité sur la protéine axine immobilisée sur des billes de sépharose a permis de mettre au point un test de mesure de l’activité kinase de GSK-3 native de cerveau de porc et de plusieurs autres espèces (levure, oursin et cellules MCF7) (Article 1). Il est important de noter que cette méthode de purification ne permet pas de séparer GSK-3α de GSK-3β. Ce test est utilisé pour évaluer l’effet inhibiteur de différentes molécules. Ceci pourrait permettre une étude approfondie des rôles de GSK-3 et de l’effet de son inhibition sur les cellules, le but final étant de pouvoir traiter des maladies impliquant GSK-3 telles que la maladie d’Alzheimer ou le diabète.
La protéine GSK-3 du parasite responsable du paludisme, Plasmodium falciparum, a été clonée au laboratoire. PfGSK-3 représente une nouvelle cible thérapeutique. Cependant, il est indispensable de comprendre les fonctions de cette protéine, bien connu chez l’homme. Pour cela, il est nécessaire de préciser sa localisation exacte au niveau de la membrane du globule rouge infecté. Ceci est possible grâce à la microscopie électronique qui utilise des anticorps marqués spécifiques de la protéine à étudier, en l’occurrence PfGSK-3. Il semble également indispensable de connaître les différentes voies et les compartiments utilisé par la protéine pour arriver à sa localisation finale. Ceci pourrait donner des indications quant aux cibles de PfGSK-3. En effet, comme indiqué dans l’article 2, plusieurs protéines sont associées aux «Mauer’s clefts» et pourraient être des substrats de PfGSK-3. D’autre part, l’adaptine de Plasmodium falciparum, protéine également associée à la membrane plasmique, pourrait être un substrat de PfGSK-3.
L’obtention de la protéine PfGSK-3 recombinante, possédant une activité kinase, a permis la mise au point d’un criblage de molécules inhibitrices de l’activité kinase de cette protéine. Par comparaison avec l’effet de ces molécules sur l’activité de GSK-3 native de porc, très proche de la protéine humaine, nous pouvons espérer trouver une ou plusieurs molécules capables d’inhiber spécifiquement la protéine plasmodiale sans intervenir sur l’activité de la protéine humaine. Cependant, puisque ces deux protéines sont très proches tant au niveau séquence qu’au niveau structure tridimensionnelle, il serait plus judicieux de trouver un inhibiteur efficace sur la protéine plasmodiale et d’y fixer une « tête chercheuse » pour cibler spécifiquement les globules rouges. En effet, les globules rouges sains ne contiennent pas de GSK-3. Ils ne seraient donc pas affectés par l’inhibiteur. Cette technique est déjà employée pour certains traitements anticancéreux. Ainsi, les globules rouges infectés seraient détruits sans que le reste de l’organisme ne subisse d’effet secondaire trop important. En effet, dans un premier temps, les molécules présentant un effet inhibiteur sur l’activité kinase de PfGSK-3 in vitro seront testé sur des cellules humaines en culture afin d’évaluer leurs effets sur des cellules saines. Dans le cas où on n’observerait pas d’effet notable sur des cellules saines, le produit sera testé sur des globules rouges infectés, puis sur l’animal et, en cas de succès, sur l’homme.
II. Polo d’oursin Sphaerichinus granularis
Le fragment de l’ADNc de Plu1 cloné n’est pas suffisant pour obtenir une protéine kinase active. Le clonage de l’ADNc complet de Plu1 permettrait d’obtenir une protéine recombinante facilement utilisable pour des études d’interaction avec d’autres protéines et des tests d’activité kinase sur différents substrats potentiels. De plus, un criblage de molécules potentiellement inhibitrices est à envisager afin de trouver de nouveaux antimitotiques pouvant intervenir dans les traitements de certains cancers.
Après immunoprécipitation, il est apparu que 2 protéines de haut poids moléculaire sont associées à Plu1. Il est probable que la protéine de 220 kDa soit Asp et celle de 150 kDa soit KLP. Cependant, il est indispensable d’identifier ces 2 protéines de façon certaine pour pouvoir continuer l’étude biochimique et enzymatique de Plu1.
L’interaction entre Polo et Myt1 au moment de l’entrée en mitose pourrait être décisive en cas d’anomalie du cycle cellulaire. En effet, Myt1 inhibe l’entrée en mitose en séquestrant le MPF dans le cytoplasme. Les résultats obtenus au cours de ma thèse ont mis en évidence une phosphorylation de Myt1 par Polo. On peut donc émettre l’hypothèse qu’en phosphorylant Myt1, Polo lève l’inhibition et permet l’entrée en mitose. Tout ceci reste à vérifier. Il faudrait cloner l’ADNc complet de Myt1 afin de pouvoir réaliser les tests de
phosphorylation et d’inhibtion sur le MPF. Nous aurions alors confirmation, ou non, de cette hypothèse.
Il est maintenant connu que Snk intervient au niveau de la phase G0 et de la transition G1/S. Les tests effectués sur l’activité kinase de Snk sur différents substrats ont montré que Snk phosphoryle Cdc25A. Il serait intéressant d’identifier tous les sites phosphorylés sur Cdc25A par Snk et de connaître le rôle de ces phosphorylations sur le déroulement du cycle cellulaire.