______________________________________________________________________________ La conception et l'exécution de ce travail de thèse a permis le clonage du gène d’une lectine (dénommée PELa) des graines de la légumineuse Platypodium elegans, et la production en système hétérologue de la protéine. L'analyse de la spécificité de cette lectine recombinante a pu être effectuée, ainsi que la caractérisation des aspects structuraux et thermodynamiques de l’interaction avec plusieurs oligosaccharides .Ce travail contribue à la compréhension de la façon dont la reconnaissance des glucides est impliquée dans différents processus biologiques par les lectines.
La lectine recombinante A de P. elegans (PELa) spécificique pour Glc/Man, a montré une spécificité inhabituelle pour les oligosaccharides du type complexe biantenné, avec une préférence particulière pour les formes assymétriques, avec un bras 1-3 court. La protéine a montré une affinité considérable pour ce ligand, par rapport à d’autres lectines de la même famille, ce qui permet de faire un point sur la relation possible entre cette classe d'oligosaccharides et le ligand naturel de la lectine.
L'étude de la lectine des graines de P. elegans et sa caractérisation biochimique ont donc fourni des informations structurales importantes au sujet des interactions protéines-sucres nécessaires à la compréhension des mécanismes d'action, de la reconnaissance, de la spécificité et de l'affinité aux oligosaccharides complexes au niveau moléculaire. Une fois en possession de ces informations, l’analyse de la capacité de la lectine à reconnaître les glycannes impliqués dans des événements biologiques intéressants, ou la recherche de sa fonction dans l'organisme d'origine, pourront être entreprises.
Le plus grand défi maintenant sera de tenter de répondre à la question sur l'importance biologique de cette interaction pour la plante d'origine: quels sont les événements liés, quelles sont les étapes de la vie de l’organisme impliquées et comment ces processus peuvent-ils être explorés. La connaissance du gène et de la forme recombinante de la lectine, combinée avec la connaissance de son interaction avec des oligosaccharides complexes, sont des outils importants de départ pour cette approche.
54
V. Résume sur les autres travaux
réalisés au cours de la thèse.
Les travaux impliquant l'analyse structurale, la spécificité et l'affinité de PELa sous sa forme recombinante ont été utilisés pour la rédaction de cette thèse, car ils rassemblent une grande quantité de résultats obtenus par la collaboration des équipes françaises et brésiliennes. Deux autres projets ont été débutés dans le cadre de cette collaboration mais les difficultés techniques rencontrées dans la purification des protéines et/ou d’obtention du matériel génétique à partir des échantillons biologiques n’ont pas permis d’aller aussi loin que pour PELa.
Protéine Justification Objectif Situation/problèmes
Lectine de l’algue Codium isthmocladum
Très peu de lectines ont pu être isolées et caractérisées à partir d’algues.
Le laboratoire brésilien a pu mettre en évidence une activité lectine dans les extraits de l’algue verte C. isthmocladum.
- Clonage et expression hétérologue
- Cristallisation en complexe avec les métaux lourds
Après plusieurs tentatives, nous avons préparé l’ADN génomique de l’algue. Les tentatives pour identifier le gène de la lectine à partir d’amorces correspondant à la séquence N-terminale se sont révélées infructueuses.
Lectine de graine de la mimosaidé Albizia lebbeck
Les mimosaidés contiennent des lectines de la famille de la Jacaline. Les études préliminaires menées au Brésil ont montré que les extraits de graine d’A. lebbeck (ALL) ont une activité lectine spécifique du galactose.
- Etude de la specificité - Clonage et expression hétérologue
La lectine a été envoyée au CFC pour être testée sur les puces à sucre après marquage. Aucune interaction significative n’a été observée, probablement du à une détérioration de la lectine au cours du marquage ou du transport.
Le clonage a été tenté à partir des ARNs de graines. Cependant il n’a pas été possible d’identifier le gène de la lectine à partir des amorces préparées avec plusieurs stratégies.
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Pendant la période du doctorat, d'autres projets ont été réalisés dans chacune des deux universités.
Des projets concernant des lectines végétales ont été exécutés à l'Université Fédérale de Ceará, résultant en sept publications comme co-auteur. Les travaux ont porté sur l’étude de la spécificité et des effets biologiques de la lectine de Canavalia brasiliensis (ConBr), des lectines spécifiques pour le manose et le lactose de Cymboseman roseum (CRLI e CRLII), de la lectine de Dioclea rostrata (DrosL) et de la lectine de Dioclea wilsonii (DwiiL). Ces études ont été publiées dans les revues suivantes (plus six travaux qui ont été publiés pendant les stages de license et master).
1. PIRES, A. F., ASSREUY A. M., LOPES, E. A., CELEDÔNIO, N. R., SOARES, C. E., RODRIGUES, N. V., SOUSA, P. L., BENEVIDES, R. G., NAGANO, C. S., CAVADA, B. S., LEAL-CARDOSO, J. H., COELHO-DE-SOUZA, A. N., SANTOS, C. F. Opioid-like antinociceptive effects of oral administration of a lectin purified from the seeds of Canavalia brasiliensis. Fundam. Clin. Pharmacol. (Print), 2011
2. BEZERRA, E. H. SA., ROCHA, B. A. M., NAGANO, C. S., BEZERRA, G. A., MOURA, T. R., BEZERRA, M. J. B., BENEVIDES, R. G., SAMPAIO, A. H., DELATORRE, P., CAVADA, B. S. Structural analysis of ConBr reveals molecular correlation between the carbohydrate recognition domain and nitric oxide release from endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 408 (4): 566 - 570, 2011.
3. DAM, T. K., CAVADA, B. S., NAGANO, C. S., ROCHA, B. A., BENEVIDES, R. G., NASCIMENTO, K. S., DE SOUSA, L. A., OSCARSON, S., BREWER, C. F. Fine specificities of two lectins from Cymbosema roseum seeds: a lectin specific for high-mannose oligosaccharides and a lectin specific for blood group H type II trisaccharide. Glycobiology. 2011 Jul;21(7):925-33.
4. ROCHA, B. A. M., DELATORRE, P., OLIVEIRA, T. M., BENEVIDES, R. G., PIRES, A. F., SOUSA, A. A. S., SOUZA, L. A. G., ASSREUY, A. M. S., DEBRAY, H., AZEVEDO, W. F., SAMPAIO, A. H., CAVADA, B. S. Structural basis for both pro- and anti-inflammatory response induced by mannose-specific legume lectin from Cymbosema roseum. Biochimie (Paris), 93: 806 - 816, 2011.
5. FIGUEIREDO, JOZI G., B., FLÁVIO S., MOTA, M. R. L., SILVESTRE, P. P., AGUIAR, C. N., BENEVIDES, R. G., NASCIMENTO, K. S., MOURA, T. R., DAL-SECCO, D., ASSREUY, A. M. S., CAVADA, B. S. Pharmacological analysis of the neutrophil migration induced by D. rostrata lectin: Involvement of cytokines and nitric oxide. Toxicon (Oxford), 54: 736 - 744, 2009.
6. ROCHA, B. A. M., MORENO, F. B. M. B., DELATORRE, P., SOUZA, E. P., MARINHO, E. S., BENEVIDES, R. G., RUSTIGUEL, J. K. R., SOUZA, L. A. G., NAGANO, C. S., DEBRAY, H., SAMPAIO, A. H., AZEVEDO, W. F., CAVADA, B. S. Purification, Characterization, and Preliminary X-Ray Diffraction Analysis of a Lactose-Specific Lectin from Cymbosema roseum Seeds. Applied Biochemistry and Biotechnology , 152: 383 - 393, 2009.
7. OLIVEIRA, T. M., DELATORRE, P., ROCHA, B. A. M., SOUZA, E. P. , NASCIMENTO, K. S., BEZERRA, G. A. , MOURA, T. R., BENEVIDES, R. G., BEZERRA, E. H. S., MORENO, F. B., CAVADA, B. S. Crystal structure of Dioclea rostrata lectin: Insights into understanding the pH-dependent dimer-tetramer equilibrium and the structural basis for carbohydrate recognition in Diocleinae lectins. Journal of Structural Biology , 164: 177 - 182, 2008.
8. BEZERRA, G. A., OLIVEIRA, T. M., MORENO, F. B. M. B., SOUZA, E. P., ROCHA, B. A. M.,
BENEVIDES, R. G., DELATORRE, P., AZEVEDO, W. F., CAVADA, B. S. Structural analysis of Canavalia maritima and Canavalia gladiata lectins complexed with different dimannosides: new insights into the understanding of the structure-biological activity relationship in legume lectins.. Journal of Structural Biology. , 160: 168 - 176, 2007.
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9. ALENCAR, N. M., ASSREUY, A. M., HAVT, A., BENEVIDES, R. G., MOURA, T. R., SOUSA, R. B., RIBEIRO, R. A., CUNHA, F. Q., CAVADA, B. S. Vatairea macrocarpa (Leguminosae) lectin activates cultured macrophages to release chemotactic mediators. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 374: 275 - 282, 2007.
10. DELATORRE, P., NASCIMENTO, K. S., MELO, L. M., SOUZA, E. P., ROCHA, B. A. M., BENEVIDES, R. G., OLIVEIRA, T. M., BEZERRA, G. A., BEZERRA, M. J. B., CUNHA, R. M. S., CUNHA, F. A. B., FREIRE, V. N., CAVADA, B. S. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the lectin from Dioclea rostrata Benth seeds. Acta Crystallographica. Series F. , 62: 166/62 - 168, 2006.
11. MOTA, M. R., CRIDDLE, D. N., ALENCAR, N. M., GOMES, R. C., MEIRELES, A. V., SANTI-GADELHA, T., GADELHA, C. A., OLIVEIRA, C. C., BENEVIDES, R. G., CAVADA, B. S., ASSREUY, A. M. Modulation of acute inflammation by a chitin-binding lectin from Araucaria angustifolia seeds via mast cells. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology , 374: 1 - 10, 2006.
12. MORENO, F. B. M. B., BEZERRA, G. A., OLIVEIRA, T. M., SOUZA, E. P., ROCHA, B. A. M.,
BENEVIDES, R. G., DELATORRE, P., CAVADA, B. S., AZEVEDO, W. F. New crystal forms of Diocleinae lectins in the presence of different dimannosides. Acta Crystallographica. Series F, 62: 1100 - 1103, 2006.
13. CAVADA, B. S., MARINHO, E. S., SOUZA, E. P., BENEVIDES, R. G., DELATORRE, P., SOUZA, L. A. G., NASCIMENTO, K. S., SAMPAIO, A. H., MORENO, F. B. M. B., RUSTIGUEL, J. K. R., CANDURI, F., AZEVEDO, W. F., DEBRAY, H. Purification, partial characterization and preliminary X-ray diffraction analysis of a mannose-specific lectin from Cymbosema roseum seeds. Acta Crystallographica. Section F, 62: 235 - 237, 2006
Au cours du stage en co-tutelle à l'étranger, un autre projet majeur a également été entrepris au CERMAV, portant sur l’étude structurale et l’analyse de la spécificité de la lectine B de Burkolderiacenocepacia (BclB), impliquant la production et l’analyse des deux domaines de cette lectine. B. cepacia est un ensemble de bactéries à gram négatif qui comprend plusieurs espèces très similaires sur le plan phénotypique, et qui sont responsables d’épidémies, en particulier chez les patients atteints de la mucoviscidose. Les glycoconjugués ont un rôle important dans les phénomènes de reconnaissance moléculaire hôte-pathogène. L'arsenal que les organismes pathogènes utilisent pour reconnaître, adhérer et infecter leur hôte comprend divers types de protéines, dont un certain nombre de lectines et adhésines. Certaines bactéries du complexe BCC possèdent dans leur génome quatre séquences homologues au gène lecA codant pour la lectine PA-IIL chez Pseudomonas aeruginosa. L’analyse de la séquence protéique traduite du génome de B. cenocepacia J2314 montre que la protéine BclB de 243 résidus (25,4 kDa) est composée de deux domaines : un domaine N-terminal de 128 acides aminés et de fonction inconnue et un domaine lectine C-terminal similaire à la lectine PA-IIL. Un travail de thèse effectué avant cette date (Emilie Lameignère), décrit le clonage du domaine C-terminal et décrit sa spécificité pour le fucose pour les oligosaccharides fucosyés Lewis a, Lewis X, et H type. Dans ce contexte, le domaine BclB C-terminal a été cristallisé en présence des ligands Lewis a, H type 1 et 2. Les données de diffraction des rayons X ont été mesurées pour les cristaux en complexes avec les trisaccharides H type 1 et 2, et sont actuellement en train d’être traitées et analysées. Le domaine N-terminal a également été cloné et exprimé et la cristallisation
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a pu être possible après optimisation de la taille du gène. En l’absence de similarité avec des protéines connues, le remplacement moléculaire ne peut être utilisé et la protéine a donc été exprimée dans un milieu riche en séléniométhionine. La structure cristallographique a pu être ainsi résolue. Ce domaine semble constituer un motif similaire à celui présent dans la chaîne légère des complexes dynéine, une protéine motrice des microtubules, pili ou flagelles. Une publication est en cours de rédaction.
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