O estado de oligomerização de um receptor nuclear pode influenciar em sua atividade. Os TRs, assim como muitos outros receptores nucleares, desempenham suas funções como heterodímeros com o RXR, homodímeros ou monômeros. Entretanto, a forma como o TR se auto-associa em solução e a maneira como o ligante governa esse processo ainda não tinham sido estudadas sistematicamente. Nesse trabalho foi analisado os estados oligoméricos do TR 1 em solução, utilizando-se de três construções diferentes (DBD-LBD, LBD sem hinge e LBD com hinge), através das técnicas de gel filtração, gel nativo, crosslinking e DLS. Também se analisou duas construções do TR α1, uma da proteína completa e a outra dos domínios DBD-LBD, através de gel nativo e DLS.
Os resultados demonstraram que o TR 1 LBD-DBD apresenta-se como tetrâmeros em solução, e que a adição do hormônio T3 leva à sua dissociação em dímeros. O TR 1
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LBD com hinge, na ausência de ligantes, apresenta-se como uma mistura de formas oligoméricas (tetrâmeros, dímeros e monômeros), as quais são concentração-dependentes. Nesse caso, a adição de ligantes também leva à dissociação das formas oligoméricas maiores em espécies menores. Esses resultados foram organizados em um artigo científico, o qual foi publicado em revista internacional (conforme apresentado no Anexo1).
A construção do TR 1 LBD sem hinge apresenta-se como uma mistura de monômeros e dímeros, sem distinção quanto a presença ou não de ligantes. O TR α1 apresenta-se majoritariamente em sua forma dimérica, independente da concentração protéica e da presença da região N-terminal. Além disso, a presença do ligante parece não interferir no estado de oligomerização dessa isoforma.
Esses resultados indicam que (1) o TR 1 também é capaz de se tetramerizar em solução, o que poderia resultar em uma forma de regulação semelhante à do RXR, através do auto-silenciamento; (2) a capacidade de tetramerização ocorre no domínio LBD de forma concentração-dependente. Este domínio possui as interfaces de dimerização e tetramerização, porém, a presença do DBD poderia servir para a estabilização desses oligômeros; (3) a presença do hinge parece ser de grande importância para a formação dos tetrâmeros do TR 1; e (4) a presença do ligante causa a dissociação dos tetrâmeros do TR 1. Além disso, pode se concluir que (5) a capacidade de tetramerização do TR está restrita à isoforma , pois a isoforma α1 apresenta-se predominantemente dimérica; e (6) a presença do ligante T3 e do DNA não causam modificações no estado de oligomerização da isoforma α1 do receptor. Esse trabalho revela as primeiras evidências da tetramerização do TR na ausência de seu ligante cognato e que esta propriedade não é restrita ao RXR, e, mais ainda, demonstra que a capacidade de tetramerização pode ser isoforma específica.
O comportamento do TR 1 em solução contrasta com o comportamento de uma construção similar de outro receptor o RAR, o qual também forma heterodímeros com o RXR. Este receptor não forma dímeros nem tetrâmeros em solução e existe estritamente como
Capítulo 4 – Oligomerização do TR
100monômero142. Assim como o RXR, o TR possui a capacidade de formar oligômeros em solução, e estas espécies estão em um equilíbrio dinâmico, dependente da concentração do receptor. Os monômeros do TR só são detectáveis a baixas concentrações, enquanto que os tetrâmeros tendem a ser predominantes nas altas concentrações de proteínas, contudo, o equilíbrio entre as espécies é reversível.
Os tetrâmeros são as formas predominantes do apo-TR em concentrações acima de 10 µM (Fig. 21). Entretanto, eles podem se dissociar rapidamente após a adição do ligante. A aplicação dos tetrâmeros e dímeros na coluna de gel filtração – a qual resulta em uma diluição da proteína em torno de quinze vezes – resulta em uma mistura de formas oligoméricas menores nas frações eluídas, o que pode explicar a dependência da concentração na formação dos oligômeros. Os tetrâmeros e dímeros podem se dissociar rapidamente em dímeros e monômeros, respectivamente, enquanto passam pela coluna. Assim como o RXR, o equilíbrio entre as formas oligoméricas do TR pode ser fortemente influenciado pelo ligante, promovendo a dissociação deste em dímeros. Essa informação, aliada às previamente expostas sugere que a formação de tetrâmeros de RXR e TR podem envolver mecanismos similares. Já a forma predominante do TR α1 é a dimérica independente da presença de ligantes ou DNA (Fig 32), o que poderia evidenciar uma forma de regulação diferente entre as isoformas de um mesmo receptor.
Enquanto o apo-RXR interage fracamente com correpressores, o apo-TR possui interações bastante fortes com essas moléculas. Portanto, não se sabe qual a fração do apo- TR poderia ser disponível para a formação de homotetrâmeros, sob condições típicas, e se esse processo seria de grande importância na regulação da ação dos TRs. Entretanto, é sabido que fatores de transcrição são freqüentemente seqüestrados em pequenas sub-regiões do núcleo, ou concentrados como multímeros em sítios de promotores alvos no DNA. Com base nesses eventos, a concentração de TR no núcleo celular poderia ser elevada, contribuindo com a formação dos tetrâmeros.
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Além da formação dos tetrâmeros, esse trabalho também reporta os efeitos do ligante T3, o qual inibe também a formação de dímeros em algumas condições. Conforme demonstrado nos experimentos de gel filtração, o apo-TR em baixas concentrações está presente em solução, majoritariamente, como dímero (Rh 4,2 nm), enquanto o holo-TR é predominantemente monomérico sob as mesmas condições (Fig. 24). O T3 promove a dissociação dos homodímeros TR -TR dos elementos responsivos de DNA, entretanto as bases moleculares que explicam esse fato ainda não são claras. Seria interessante especular se este efeito está relacionado com alterações no equilíbrio monômero-dímero de maneira hormônio-dependente (ou independente). Com isso, seria possível investigar a possibilidade do ligante influenciar na atividade de ligação TR-DNA, através de efeitos diretos na conformação da superfície de dimerização do LBD do TR.
A tetramerização é um evento freqüente na regulação do reconhecimento proteína- DNA e na regulação da transcrição143, 144, 145. Em vista das evidências encontradas para a formação de tetrâmeros dos receptores TR e RXR humanos, seria interessante o questionamento se a auto-associação em tetrâmeros poderia representar um nível geral de regulação celular, sinalizada pelos receptores nucleares. A auto-montagem dos receptores nucleares em formas tetraméricas inativas dentro da célula poderia contribuir para o acúmulo e estoque desses receptores, os quais poderiam ser facilmente disponíveis para a ativação na presença de um ligante ou DNA específico ou, até mesmo, pela queda na concentração desses receptores.