Os experimentos de PCR em tempo real foram desenvolvidos com o intuito de validarmos os resultados obtidos no estudo da expressão gênica global durante o processo de reparação tissular.
Para o desenvolvimento destes experimentos, perfurações de 2mm foram desenvolvidas nas orelhas dos camundongos AIRmaxSS e AIRminSS. Nos períodos de 24 horas, 10 e 30 dias após a perfuração, as orelhas foram coletadas para a obtenção do RNA mensageiro e a síntese do cDNA, o qual foi utilizado nas reações de qPCR.
Para isso, selecionamos alguns genes representativos, com funções importantes na determinação dos fenótipos, regenerativo e de cicatrização, e que foram diferencialmente expressos entre as linhagens. Os genes estudados foram: Il1b, Cxcl2, Col1a1, Col3a1, Mmp9, Fn1, Tnc, Krt6a, Actn3 e Tgfb. É importante salientar que os primers escolhidos para os decorrentes experimentos apresentaram uma eficiência próxima de 100%.
Nestas análises, as amostras foram normalizadas por meio da subtração do valor do gene constitutivo ciclofilina (chamado de Ct) e calibradas por meio da subtração do valor de Ct dos animais AIRminSS controle, também chamado de calibrador comum, e os resultados abaixo estão expressos por meio da fórmula 2-Ct (como descrito nos Materiais e Métodos).
4.2.1 Níveis de expressão dos genes Il1b e Cxcl2
No período de 24 horas após a perfuração das orelhas, observamos aumento na expressão dos genes Il6 e Cxcl2, seguida de uma diminuição nos níveis destes transcritos após 10 e 30 dias de experimentação que pode ser comparada aos níveis basais dos animais controle (figura 23 A e B).
C 24h 10d 30d
Figura 23: Expressão relativa dos genes Il1b (A) e Cxcl2 (B), a partir do cDNA obtido das orelhas de
animais submetidos ao protocolo de perfuração tecidual ou não (controle). Foram utilizados animais experimentais (24h, 10d e 30d) e controles (n=4). Os resultados estão
expressos em média ± desvio padrão. * p<0,05 – entre AIRmaxSS e AIRminSS.
4.2.2 Níveis de expressão dos genes Col1a1, Col3a1 e Mmp9
Os genes Col1a1, Col3a1 e Mmp9 envolvidos na reparação tissular após a lesão na orelha foram estudados. O colágeno é conhecido por ser uma proteína de importância fundamental na constituição da matriz extracelular, em contrapartida, as metaloproteinases são enzimas proteolíticas importantes na degradação da matriz extracelular e no remodelamento tecidual, e participam durante todas as fases da reparação dos tecidos.
Na figura 24 A e B podemos observar alta expressão dos genes Col1a1 e Col3a1 nos períodos de 10 dias e 30 dias após a injúria. Aos 10 dias após a lesão, os animais AIRmaxSS expressaram níveis maiores do gene Col1a1, enquanto que para o gene Col3a1 não foram observadas diferenças significativas nos níveis de expressão entre as sublinhagens em todos os períodos avaliados.
Considerando a expressão do gene Mmp9, observamos que não houve alterações nos animais AIRmaxSS durante toda a cinética, embora a expressão desse gene nesses animais tenha sido superior à dos animais AIRminSS em situação basal, aos 10 dias e 30 dias após a injúria.
Os animais AIRminSS apresentaram alta e relevante expressão do gene Mmp9 apenas após 24 horas de lesão. Esta expressão foi significativamente maior do que a observada nos animais AIRmaxSS neste período (Figura 24 C).
C 24h 10d 30d
B A
C 24h 10d 30d
Figura 24: Expressão relativa dos genes Col1a1 (A), Col3a1 (B) e Mmp9 (C) a partir do cDNA
obtido das orelhas de animais submetidos ao protocolo de perfuração tecidual ou não (controle). Foram utilizados animais experimentais (24h, 10d e 30d) e controles (n=4).
Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. * p<0,05 – entre AIRmaxSS e
AIRminSS.
4.2.3 Níveis de expressão dos genes Fn1, Tnc, Krt6a e Actn3
Alguns genes que codificam proteínas de matriz extracelular também foram diferencialmente expressos no estudo da expressão gênica global e foram validados pelo PCR em tempo real. As proteínas de matriz testadas foram: a fibronectina 1 e a tenascina C. No período de 24 horas após a injúria, os animais AIRminSS apresentaram maior expressão dos genes Fn1 e Tnc em comparação aos animais AIRmaxSS. Aos 10 dias de lesão, os animais AIRminSS continuaram a expressar maiores níveis de transcritos do gene Fn1 em comparação aos camundongos AIRmaxSS, mas não do gene Tnc, que foi mais expresso na orelha dos animais AIRmaxSS neste período. Posteriormente, aos 30 dias de lesão, não observamos
C 24h 10d 30d
C 24h 10d 30d
B
C A
diferenças significativas quanto à expressão dos genes Fn1 e Tnc entre as sublinhagens (Figura 25 A e C).
O gene Krt6a, envolvido na síntese de queratina e na formação de um novo tecido após a injúria, apresentou baixos níveis de expressão, mas ainda exibiram níveis significativamente maiores na orelha dos animais AIRminSS, nos períodos de 24 horas e 30 dias após a injúria, em comparação aos animais AIRmaxSS (Figura 25
B).
Posteriormente, conferimos a expressão do gene alfa actina 3 (Actn3), um gene expresso principalmente por miofibroblastos e altamente envolvido na contração da injúria e na formação da cicatriz durante a reparação de uma lesão. Embora tenha ocorrido um aumento na expressão de Actn3 no período de 10 dias após a lesão na orelha, esse aumento não se mostrou expressivo entre as sublinhagens. Por outro lado, aos 30 dias houve uma expressão altamente significativa deste gene na orelha dos animais AIRminSS em comparação à orelha dos animais AIRmaxSS (Figura 25 D). Neste experimento, os animais AIRmaxSS controles exibiram expressão aumentada de Actn3 nas orelhas sem perfuração comparada aos animais AIRminSS controles (Figura 25 D).
Figura 25: Expressão relativa dos genes Fn1(A), Krt6a (B), Tnc (C) e Actn3(D), a partir do cDNA
obtido das orelhas de animais submetidos ao protocolo de perfuração tecidual ou não (controle). Foram utilizados animais experimentais (24h, 10d e 30d) e controles (n=4). Os
resultados estão expressos em média ± desvio padrão. * p<0,05 – entre AIRmaxSS e
AIRminSS.
4.2.4 Níveis de expressão gênica do gene Tgfb
Embora o gene Tgfb seja participante durante todas as fases do processo de resolução tissular, em nosso estudo, houve uma alteração na expressão de Tgfb apenas 24 horas após a injúria a favor dos animais AIRminSS. Aos 30 dias, a expressão do gene foi a mesma observada nos animais controles (Figura 26).
C 24h 10d 30d C 24h 10d 30d C 24h 10d 30d C 24h 10d 30d A B C D
Figura 26: Expressão relativa do gene Tgfb a partir do cDNA obtido das orelhas de animais
submetidos ao protocolo de perfuração tecidual ou não (controle). Foram utilizados animais experimentais (24h, 10d e 30d) e controles (n=4). Os resultados estão expressos
em média ± desvio padrão. * p<0,05 – entre AIRmaxSS e AIRminSS.
Ao final dos experimentos de expressão gênica, avaliamos a existência de correlação significativa, por meio da análise do coeficiente de correlação de Pearson, entre os ensaios de microarray e os de reações de polimerização em cadeias quantitativos. Verificamos que houve correlação entre os experimentos, com valor de r=0,70.