Dans ce projet de doctorat, j’ai étudié les interactions moléculaires des rAMPA aux synapses dans les paradigmes de plasticité. Au début du projet, seulement deux laboratoires
utilisaient la technique de suivi de molécules uniques appliquée aux récepteurs neuronaux (Meier, Vannier et al. 2001; Serge, Fourgeaud et al. 2002). De plus, l’utilisation des points quantiques comme sonde fluorescente n'en était qu’à ses balbutiements (Dahan, Levi et al. 2003; Groc, Heine et al. 2004). Contrairement à aujourd’hui, il était impossible d’acheter commercialement les points quantiques et on devait se les procurer chez les laboratoires producteurs (Dubertret, Skourides et al. 2002). J’ai donc eu à développer la technique de suivi de molécules uniques à partir de zéro dans le laboratoire, incluant l'identification i) d'anticorps disponibles sur le marché qui sont suffisamment spécifiques pour l'application (qui s'avèrent rares), et ii) de QD suffisamment stables, bio-compatibles et fonctionnalisés. Une fois trouvés, j'ai mis au point iii) les conditions d'application d'anticorps-QD sur les neurones, iv) les protocoles d’imagerie optique et v) les programmes d’analyse de suivi de molécules uniques. La somme de temps que toutes ces étapes ont nécessité fut considérable (presque quatre ans), particulièrement en raison de la portion programmation, de quelques difficultés rencontrées au niveau de la spécificité des anticorps, de la disponibilité d'outils moléculaires et des QD de qualité, et de ma transition de la physique au domaine des neurosciences. Le chapitre 2 décrira l’implémentation de la technique de suivi de points quantiques uniques sur les récepteurs neuronaux.
Une fois la technique bien établie, je me suis penché sur les mécanismes d’immobilisation des récepteurs aux synapses lors de la plasticité synaptique. Il n’était pas encore connu comment les changements locaux de diffusion des récepteurs sont régulés dans la plasticité synaptique. Lors de processus de la LTP, les mécanismes sous-tendant les changements dans le nombre de récepteurs à la membrane étaient peu connus. Quelles sont les protéines postsynaptiques impliquées dans l’augmentation des récepteurs aux synapses? On savait que la CaMKII a une implication essentielle dans la LTP et qu’elle translocalise aux synapses lors de l’activité synaptique (Shen and Meyer 1999; Hudmon, Lebel et al. 2005). Cependant, aucun mécanisme n’avait été décrit qui mettait en lien l’immobilisation des récepteurs aux synapses et la CaMKII. C’est dans cette optique que s’inscrit le chapitre 3. Pour répondre à ces questions, j’ai utilisé la technique d’imagerie de molécules uniques des rAMPA aux synapses combinée avec l’imagerie optique en fluorescence, la pharmacologie et des outils génétiques modifiant la CaMKII. Aussi, j’ai mis en place des
paradigmes de plasticité qui induisent la LTP dans les neurones de l’hippocampe en culture afin d’évaluer les mécanismes moléculaires qui permettent de varier le nombre de récepteurs aux synapses.
Ensuite, je me suis intéressé à deux différents isoformes (α et β) de la CaMKII et leurs implications dans la diffusion des rAMPA aux synapses ainsi que dans la plasticité. Les fonctions de l’αCaMKII dans la plasticité synaptique ont été largement étudiées (Malinow, Schulman et al. 1989; Pettit, Perlman et al. 1994; Hayashi, Shi et al. 2000; Bayer, De Koninck et al. 2001; Sanhueza, Fernandez-Villalobos et al. 2011). Cependant, très peu de travaux démontrent l’implication de la βCaMKII dans la régulation des rAMPA. On sait cependant que, dans le développement et la plasticité, la βCaMKII est cruciale pour le maintien de la structure des synapses (Fink, Bayer et al. 2003; Okamoto, Narayanan et al. 2007). À l’aide des techniques développées précédemment, j’ai étudié l’impact des deux sous-unités αCaMKII et βCaMKII dans la régulation de la diffusion des rAMPA aux synapses. Au chapitre 4, je démontre que les deux isoformes sont essentielles à la stabilisation des récepteurs aux synapses et j’ai mesuré des effets différentiels pour chaque isoforme (α/β) sur les rAMPA aux synapses dans l’activité basale et lors de protocoles de plasticité.
Je me suis aussi intéressé aux mécanismes reliant la CaMKII et l’apport de récepteurs à la membrane par exocytose (chapitre 5). Lors de la LTP, il est possible qu’une augmentation de la fréquence des événements d’exocytose des rAMPA à la membrane postsynaptique apporte un plus grand nombre de récepteurs disponibles aux synapses (Patterson, Szatmari et al. 2010). Pour évaluer le rôle de la CaMKII dans l’exocytose des RAMPA, j’ai utilisé un protocole d’imagerie développé par Yudowski et al. afin de résoudre directement les événements unitaires d'insertion des rAMPA à la surface des neurones (Yudowski, Puthenveedu et al. 2007). Nous avons mesuré que l’amplitude des événements unitaires d’exocytose de GluA1-SEP est plus basse en absence de l’αCaMKII. La CaMKII régule donc le nombre de récepteurs dans les vésicules ou une population de vésicules dans les neurones.
Dans les chapitres 6-7, je discuterai des conséquences de nos découvertes dans un contexte de transmission synaptique et de plasticité. Je discuterai de nouvelles techniques qui permettront d’approfondir notre connaissance au niveau moléculaire de l’apprentissage et de la mémoire.
Finalement, ce travail veut établir la notion que les rAMPA résident dans la membrane plasmique et dans les sites postsynaptiques avec un haut degré de mobilité (Borgdorff and Choquet 2002; Choquet and Triller 2003; Tardin, Cognet et al. 2003; Choquet 2010); que l’implication de l’enzyme CaMKII est cruciale dans la régulation de la diffusion des récepteurs aux synapses (Asrican et al., 2007, Hayashi et al., 2000, Lee et al., 2009, Lisman et al., 2002, Merrill et al., 2005); que la synapse doit être considérée comme un milieu statistique anisotrope et que tous les facteurs (chimiques, électriques) qui interfèrent avec la dynamique du récepteur vont avoir un impact sur le nombre de récepteurs aux synapses et ainsi modifier la force de la transmission synaptique excitatrice (Triller and Choquet 2008). Ceci est un mécanisme général dans la régulation de la transmission synaptique, l’apprentissage et la mémoire.