Notre travail a consisté à étudier i) si les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) étaient capables d’internaliser et de dégrader la sérotonine, ii) l’effet de différentes concentrations en 5-HT sur la survie des CSMs, iii) la faisabilité d’encapsuler les CSMs dans des microparticules d’alginate, iv) la fonctionnalité et la différenciation des CSMs dans ces microsphères et v) la possibilité de greffer ces microsphères contenant les CSMs dans les organes solides.
Plusieurs équipes ont développé des stratégies permettant d’améliorer la survie des cellules souches greffées dans le parenchyme d’organes solides. Le plus souvent, il s’agit d’approches de thérapie génique combinées à la thérapie cellulaire. Mais une autre stratégie pour améliorer la survie cellulaire après la greffe pourrait être de protéger les cellules de l’environnement tissulaire, en les protégeant des augmentations de certains facteurs (la 5- HT par exemple) qui peuvent apparaitre dans diverses pathologies. Plusieurs études ont montré que la 5-HT pouvait influencer le comportement des CSMs (neuroplasticité, prolifération) via ses récepteurs et plus particulièrement via le récepteur 5-HT2. Mais ces études n’ont pas exploré l’effet non récepteur dépendant de la 5-HT dans les CSMs. Or, celles-ci possèdent le transporteur de la 5-HT et la monoamine oxydase A ce qui démontre qu’elles sont capables d’internaliser la 5-HT et de la dégrader. La dégradation de la 5-HT par la MAO-A génère du peroxyde d’hydrogène (H2O2) qui peut exercer des effets délétères sur les cellules. Nos résultats montrent pour la première fois que la voie de dégradation de la 5-HT SERT/MAO-A est exprimée dans les CSMs.
Un des effets que l’H2O2 peut exercer sur les cellules est l’induction de l’apoptose. Bien qu’il est été démontré que suivant la concentration utilisée, la 5-HT pouvait avoir des effets différents (prolifération ou apoptose) sur les cardiomyocytes, les effets de différentes concentrations en 5-HT sur les CSMs ont été peu étudiés. Un traitement avec de fortes concentrations en 5-HT induit une diminution du marquage par le Syto 13 et une augmentation de l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl2. Ces effets de la 5-HT étant reversés par la pargyline, un inhibiteur des MAO et par l’imipramine, un inhibiteur de SERT. Ces résultats montrent que la voie de dégradation de la 5-HT SERT/MAO-A est impliquée dans l’apoptose des CSMs induite par la 5-HT.
Une autre stratégie pour améliorer la survie cellulaire se développe depuis quelques années, c’est la microencapsulation des cellules. La plupart des études portent sur des microcapsules à membrane semi-perméable fournissant un immunoisolement aux cellules. Cependant, cette membrane pose des problèmes de biocompatibilité puisque le polymère utilisé pour sa fabrication peut être impliqué dans des phénomènes de rejet. Comme les CSMs sont peu immunogènes, on peut se contenter de les encapsuler dans des microsphères ce qui permet de simplifier le protocole de fabrication. Ces microsphères les protègeront des contraintes mécaniques lors de la greffe et les concentreront pour amplifier leur effet paracrine. Mais nous avons du déterminer si ces microsphères étaient adaptées aux CSMs car leur utilisation est encore peu étudiée. Ainsi, malgré des différences morphologiques et de propriété mécaniques, les microsphères et les microcapsules restent stables au cours du temps. En revanche, les CSMs présentent une meilleure survie dans les microsphères que dans les microcapsules. Ces résultats montrent que l’encapsulation des CSMs dans les microsphères est plus efficace que leur encapsulation dans les microcapsules pour notre application.
En plus d’améliorer la survie cellulaire, la microencapsulation des CSMs a pour but de potentialiser leur activité paracrine en les concentrant au site de la greffe. En effet, de nombreux travaux indiquent que les CSMs sécrètent un large panel de cytokines telles que VEGF, HGF, b-FGF et l’angiopoétine. Dans notre étude, nous avons montré que l’encapsulation des CSMS dans les microsphères ne modifiait pas leur production de b-FGF en comparaison avec les CSMs non encapsulées. De plus, des études ont montré que la configuration des cellules à l’intérieur des microparticules pouvait influencer leur différenciation en lignage chondrocytaire. Nos résultats ne montrent aucune différenciation des CSMS en chondrocytes dans les microsphères au cours de l’étude. Les CSMs sont donc viables, fonctionnelles et ne se différencient pas dans les microsphères d’alginate testées.
La dernière incertitude vis-à-vis des microsphères était la possibilité de les greffer sur les organes solides car jusqu’à maintenant elles ont été greffées essentiellement au niveau de l’os. Les contraintes mécaniques étant différentes pour les organes solides, il fallait s’assurer que les microsphères ne se dégraderaient pas au cours du temps. Nos résultats montrent que les microsphères contenant les CSMs peuvent être facilement greffées sous la capsule
rénale de rat, que cette greffe n’a pas d’impact sur leur fonction rénale, qu’elle n’induit pas de réponse immune chez le receveur et que les microsphères sont retrouvées intactes un mois après la greffe. Ainsi, la greffe de microsphères dans les organes solides est faisable et sure pour le receveur.
En conclusion, ces travaux ont permis de démontrer que deux stratégies peuvent être envisagées afin d’améliorer la survie des cellules au moment de leur greffe. Elles visent la régulation des interactions cellules greffées/environnement cellulaire en se plaçant soit après la greffe soit au moment précis de la greffe. On peut vouloir interférer avec les modifications biochimiques qui ont lieu dans l’organe lésé et qui sont délétères pour les cellules comme l’augmentation des taux de 5-HT. Mais on peut également encapsuler les cellules pour les protéger des contraintes mécaniques subies lors de la greffe tout en maintenant leur activité paracrine.
Des travaux de l’équipe ont montré que les CSMs peuvent moduler le phénotype des fibroblastes cardiaques ainsi que leur habilité à dégrader la matrice extracellulaire (Mias et al. 2009). D’autre part, des études ont proposé l’utilisation de patchs pour implanter les cellules au niveau du cœur (Wei et al. 2007). En effet, le cœur est plus difficile d’accès que le rein et même si des équipes ont pu greffer des microcapsules en intramyocardique, notre système de dépôt semble mal adapté à cet organe. Nos travaux ayant montré que les CSMs survivent bien et restent fonctionnelles dans des implants d’alginate, nous avons décidé de développer des patchs d’alginate ensemencés avec les CSMs et transplantés dans le cœur.
Schéma récapitulatif
Effet de l’environnement tissulaire sur les
Mort précoce dans les 48H
5-HT en conditions pathologiques
Apoptose
Protéger les CSMS de
Microsphères d’alginate
Survie Activité paracrine Greffe Cellules souches
mésenchymateuses (CSMS)
Amélioration survie après greffe Potentialisation thérapie cellulaire