Ce projet de recherche avait pour objectif la synthèse d’acides thiohydroxamiques d’une part, ainsi que la mise au point d’une séquence réactionnelle visant à obtenir les TINOs sur charpente pyranose pour pouvoir étudier leur réactivité.
Les premiers résultats des tests enzymatiques sur la S-UGT ont pu être effectués dans l’équipe du Pr. Richard Daniellou et du Dr. Pierre Lafite.
1. Synthèses des acides thiohydroxamiques, substrats de la S-UGT
Lors de ces travaux, plusieurs voies de synthèse des acides thiohydroxamiques ont été étudiées. Les difficultés rencontrées sont principalement dûes à la forte instabilité des produits finaux. Une méthode biomimétique a été développée et a conduit à l’obtention des produits attendus. Cependant, les rendements restent modérés et la pureté n’est pas optimale (Schéma 220).
Schéma 220 approche biomimétique
Dans le même temps, l’équipe de Pierce a publié la synthèse d’acides thiohydroxamiques à partir des chlorures d’hydroximoyle correspondants. Cette méthode nous a permis d’obtenir les acides thiohydroxamiques souhaités, qui après une purification sur silice C-18 ont présenté une pureté satisfaisante (Schéma 221).
Schéma 221 approche de Pierce appliquée à nos cibles
Les constantes cinétiques de l’UGT74B1 ont été déterminées vis-à-vis de l’acide thiohydroxamique benzylique. Pour l’UGT74C1, plus affine de l’acide thiohydroxamique aliphatique, ces constantes
181 cinétiques sont actuellement en cours d’étude. Actuellement, l’acide thiohydroxamique benzylique est de nouveau en cours de synthèse afin de vérifier la reproductibilité des premiers résultats enzymatiques obtenus. Différents acides thiohydroxamiques portant un groupement aromatique éloigné au minimum d’un carbone de la fonction « acide thiohydroxamique » seront synthétisés afin de comparer les constantes cinétiques en fonction de la longueur de l’espaceur. Il est également envisagé de synthétiser l’acide thiohydroxamique présentant un groupement indole à la place du phényle, toujours dans le but de comparer les affinités.
2. Synthèse et étude de réactivité des N-oxydes de thioimidate sur charpente pyranose Au départ de différents pyranoses, pentoses ou hexoses, nous avons mis au point une séquence robuste pour l’accès aux N-oxydes de thioimidate. Dans le cas du xylose et du glucose, une optimisation des étapes de protection/déprotection a permis d’améliorer le rendement global des synthèses.
L’étape clé de la synthèse des TINOs est l’étape de cyclisation. Celle-ci s’effectue par réaction de Mitsunobu intramoléculaire en série D-arabinose et D-xylose. Cette stratégie ne fonctionne pas dans le cas des hexoses. Une nouvelle méthode, inspirée de la synthèse des nitrones cycliques a été développée. C’est donc la désilylation cyclisante qui a permis d’obtenir les TINOs sur charpente L-ido et L-gulo. Une séquence d’oxydation/réduction diastéréosélective a permis l’épimérisation en C5 qui, suivie de l’étape de désilylation cyclisante nous conduit à l’obtention des TINOs de série D-gluco et D-manno (Schéma 222).
Schéma 222 résumé des TINOs synthétisés
Il serait envisageable, par la suite, de synthétiser le TINO sur d’autres charpentes pyranose, tel que le D-galactose. Nous envisageons également des approches alternatives en présence de groupements protecteurs différents des benzyles utilisés pour ces travaux, afin non-seulement de comparer les rendements, mais également de réaliser des étapes de déprotection plus aisées.
Une fois cette méthodologie développée, nous avons souhaité étudier la réactivité des TINOs synthétisés, d’une part, vis-à-vis des couplages de Liebeskind-Srogl, et d’autre part, vis-à-vis des additions nucléophiles. L’étude des couplages de Liebeskind nous a permis d’obtenir une petite
182 librairie de cétonitrones après optimisation des conditions réactionnelles. La conduite de la réaction à température ambiante, en présence de base et de CuTC comme source de Cu(I), nous a permis de nous affranchir de la présence des différents sous-produits rencontrés lors des premiers tests (Schéma 223).
Schéma 223 résultats obtenus pour le couplage de Liebeskind
Il a tout de même été intéressant d’essayer de comprendre la formation de ces différents sous-produits indésirables. Il sera d’ailleurs intéressant de continuer l’étude de formation du composé issu du couplage sur l’oxygène catalysé au cuivre. Les intermédiaires de cette réaction de couplage pourront être identifiés. Il serait également envisageable d’améliorer les conditions réactionnelles afin d’obtenir ce produit avec un meilleur rendement et une quantité moindre de cuivre. Après optimisation, une exemplification pourra être effectuée.
Les essais de cycloaddition sur la nitrone vinylique se sont révélés infructueux, le produit n’étant obtenu qu’à l’état de trace. Il serait plus judicieux, par la suite, d’effectuer l’optimisation sur une nitrone plus stable. De nouveaux essais en demande inverse avec ou sans acide de Lewis sembleraient plus prometteurs.
L’accès aux cétonitrones a également été étudié par réaction d’addition nucléophile sur le TINO. Cependant, ce dernier s’est révélé très peu réactif vis-à-vis des nucléophiles testés, tels que les organomagnésiens. Ces réactions fonctionnaient cependant très bien sur les TINOs sur charpente furanose. Notre stratégie a dû être modifiée. L’addition de thiols et d’amines s’est révélée être effective et nous a conduit à l’obtention des TINOs et N-oxydes d’amidines correspondants (Schéma 224).
183 Enfin, quelques essais de réduction des TINOs ont été effectués. Les premiers résultats semblent montrer que cette fonction est très stable en milieu réducteur, contrairement à ses analogues furanoses. La présence de DIBAL-H est nécessaire à l’addition d’un hydrure et l’élimination du SEt et conduit à la formation de l’aldonitrone correspondante. Les TINOs semblent également insensibles à l’hydrogénolyse, la débenzylation doit avoir lieu en présence de BCl3, comme décrit sur les nitrones.
3. Perspectives
3.1. Synthèse des acides thiohydroxamiques
Nous avons atteint notre objectif en synthétisant les acides thiohydroxamiques nécessaire à l’étude cinétique de l’UGT74B1. La méthode choisie semble reproductible et pourra s’appliquer à de nombreux acides thiohydroxamiques. Quelques structures peuvent être envisagées afin de modifer le pKa de l’acide thiohydroxamique qui semble jouer un rôle important dans la reconnaissance enzymatique (Figure 48).
Figure 48 structures d’acides thiohydroxamiques envisagés
D’autre part, les acides hydroxamiques correspondants aux acides thiohydroxamiques synthétisés pourront être testés comme substrats afin de comprendre la spécificité de l’enzyme pour la formation de la liaison carbone-soufre. Dans le cas de l’UGT74C1, l’influence de la variation de la longueur de la chaîne sur les constantes cinétiques pourra être étudiée.
3.2. Synthèse et étude de réactivité des TINOs
La synthèse des TINOs sur diverses charpentes pyranoses a été effectuée et une étude de réactivité a permis d’établir que cette fonction est beaucoup moins réactive sur charpente pyranose que ses homologues sur charpente furanose, vis-à-vis de réductions et d’additions nucléophiles. Cette singularité peut être dûe à un arrangement différent dans l’espace mais également à l’effet des groupements protecteurs qui ne sont pas identiques en série pyranose (benzyle) et furanose (isopropyle). Afin d’activer sa réactivité, les réactions pourront être menées en présence d’acides de Lewis chélatant (aluminium), en présence de groupements protecteurs électroattracteurs (acétyles) sur le TINO aini qu’en effectuant des réactions intramoléculaires (cycloadditions).
Les TINOs ont été engagés dans les réactions de couplage de Liebeskind-Srogl pour former des nitrones, qui peuvent être elle-même, substrats des réactions de cycloaddition. Cependant, aucun produit de cycloaddition n’a pu être isolé et caractérisé. Une réaction supplémentaire, la réaction de Kinugasa, pourra également être envisagée. Il s’agit d’une réaction de cycloaddition 1,3- dipolaire entre une nitrone et un acétylènure de Cu(I) suivi d’un réarrangement pour donner un -
184 lactame.225 En 2012, l’équipe de Furman présente une réaction de Kinugasa diastéréosélective sur des nitrones à six chaînons (Schéma 225).226
Schéma 225 exemple de réaction de Kinugasa sur une nitrone à six chaînons
Les essais de réaction de cycloaddition sur la phénylnitrone pourront être poursuivis en utilisant comme dipolarophile, le diéthylvinylphosphonate ainsi qu’en criblant différents acides de Lewis. Si le produit n’est observé qu’à l’état de traces, un changement des groupements protecteurs pourra être envisagé afin d’activer la réactivité.
D’autre part, l’exemplification des additions de thiols et d’amines pourra être poursuivie afin d’accéder à une petite librairie de N-oxydes d’amidine et de thioimidate. Après débenzylation les composés pourront être testés comme inhibiteurs de glycosidases.
Le but final serait de former la fonction thiohydroximate via le groupement vinyle puis de rompre la liaison N-O afin d’accéder après débenzylation à des iminosucre -disubstitués, inhibiteurs potentiels de la S-UGT. Une co-cristallisation de l’inhibiteur dans le site actif de l’enzyme permettrait de comprendre la position relative des différents éléments durant la formation de la liaison carbone – soufre et ainsi d’avoir une idée du mécanisme d’action de l’enzyme.
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Kinugasa, M. ; Hashimoto, S. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1972, 466 – 467.
226 Grzeszczyk, B. ; Polawska, K. ; Shaker, Y.M. ; Stecko, S. ; Mames, A. ; Woznica, M. ; Chmielewski, M. ;
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