Conclusion

Ces résultats ont confirmé l’activité antiproliférative des deux tétrasulfures, qui ont été

reportés comme inhibiteurs de CDC25A et C in vitro, sur des modèles cellulaires

d’adénocarcinome mammaire humain sensibles (MCF-7 et MDA-MB-231) et résistant

(Vcr-R). Les composés DAS

et DPS

sont capables d’induire un arrêt du cycle cellulaire en phase

G2/M qui coïncide avec l’accumulation de pCdk1 et 2 après des traitements de courte durée

(6 h). Des effets comparables ont déjà été reportés par Herman-Antosiewicz et Singh. après

traitement de cellules de cancer humain de la prostate (PC-3) par un autre OSC, DAS

. En

effet, un traitement de courte durée (8 h) par 40 µM de DAS

induit une accumulation de

pCdk1 dans ces cellules qui a pu être associée à l’activation de la kinase Chk1 et à un arrêt du

cycle cellulaire en phase G2/M (Herman-Antosiewicz et Singh 2005). Comme nous l’avons

observé, cette accumulation de Cdk1 sous sa forme inactive ne persiste pas avec le temps.

Une explication à cette observation serait la possible réaction des OSC avec des thiols

intracellulaires comme le GSH. En effet, nous avons vu précédemment que l’activité

inhibitrice de ces composés vis-à-vis des phosphatases CDC25 pouvait être partiellement

altérée in vitro en présence d’agents réducteurs comme le DTT ou le GSH. Cependant, les

données actuelles de la littérature concernant la réactivité des polysulfures avec le GSH ne

nous permettent pas de prédire à quelle vitesse ce phénomène peut intervenir dans les cellules.

De plus, nous avons constaté que l’inactivation de Cdk1 et 2 n’était pas associée à une

diminution du niveau protéique des CDC25, et notamment de CDC25C, dans les cellules

MCF-7 après 6 h de traitement par DAS

et DPS

. Contrairement à nos observations,

plusieurs études ont reporté que l’arrêt du cycle cellulaire induit par les OSC était associé à

l’inhibition de CDC25C par phosphorylation ainsi qu’à sa destruction ERO-dépendante. En

effet, les OSCs agiraient en activant des voies de signalisation ATM/ATR, impliquant Chk1,

et p38 MAPK qui contribuerait à la phosphorylation du résidu S216 de de CDC25C créant

ainsi un site de liaison à la protéine cytoplasmique 14-3-3 (Xiao et al. 2009, Yuan et al.

2003). Parallèlement à cela, Xiao et al. ont montré qu’un autre mécanisme d’inhibition de

CDC25C, indépendant de sa phosphorylation, pouvait intervenir. En effet, leur étude de 2005

a révélé que la destruction protéique de CDC25C dans les cellules PC-3 et DU145 traitées par

DAS

était dépendante de la génération d’ERO comme O

et H

O

. Ceci a été confirmé par

des expériences de préincubation en présence d’un antioxydant, la N-acétyl cystéine, qui ont

permis de réduire significativement la dégradation de CDC25C dans les cellules traitées par

DAS

. Ces résultats suggèrent que les ERO peuvent exercer des modifications directes au

niveau de la phosphatase CDC25C qui vont réduire sa stabilité (Xiao et al. 2009). Or, les

travaux de Savitsky et Finkel ont conforté cette hypothèse. Ils ont montré que la dégradation

de CDC25C induite par H

O

dans les cellules HeLa était indépendante de la phosphorylation

de CDC25C et de l’activation de Chk1. L’étude du mécanisme d’action, réalisé dans un

système acellulaire, suggère que l’oxydation directe des Cys377 (cystéine catalytique) ou

Cys330 de CDC25C par H

O

contribuerait à l’instabilité de la protéine (Savitsky et Finkel

2002).

Ainsi, nous pouvons penser que l’absence de modification du niveau protéique de CDC25C

dans les cellules MCF-7 peut s’expliquer par le fait que nous n’avons pas décelé de

changement dans leur statut redox après 6 h de traitement par DAS

et DPS

. Ceci conforte

donc l’hypothèse que l’inactivation de Cdk1 et 2, observée dans les cellules MCF-7 après 6h

de traitement, serait due à l’inhibition directe de l’activité enzymatique des CDC25A et C par

les composés DAS

et DPS

. Cependant, nous ne pouvons exclure l’implication des voies de

signalisation ATM/ATR et p38 MAPK dans l’inhibition de l’activité de ces enzymes.

Néanmoins, d’autres mécanismes d’action, impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire, ont

été identifiés (pour des revues récentes voir Scherer et al. 2009 et Iciek et al. 2009).

Notamment, Hosono et al. ont démontré, grâce à l’utilisation d’un modèle acellulaire in vitro,

que le composé DAS

inhibait la polymérisation de la tubuline. Une analyse en spectrométrie

de masse a permis de mettre en évidence que le DAS

induit l’oxydation de deux résidus

cystéine de la β-tubuline (Cys12 et 354) (Hosono et al. 2005). Enfin, il a également été

montré que les OSCs pouvaient moduler la transcription de certain gène en augmentant

l’acétylation des histones. Notamment, l’arrêt des cellules Caco-2 et HT-29 (cancers coliques)

en phase G2/M après traitement par DAS

a été associée à l’inhibition de l’activité histone

déacétylase. Dans ce cas, l’hyperacétylation des histones induit l’expression de l’inhibiteur de

Cdk, p21 (Druesne et al. 2004).

Par ailleurs, nous avons mis en évidence que les composés DAS

et DPS

étaient capables

d’induire l’apoptose des cellules MCF-7 sans perturber leur statut redox. Les résultats que

nous avons obtenus suggèrent que la mitochondrie jouerait un rôle primordial dans le

déclenchement du processus apoptotique. En effet, plusieurs études ont reporté que

l’induction de la voie de signalisation intrinsèque (mort cellulaire de type I), impliquant la

mitochondrie, est le mode d’action privilégié des OSCs dans l’induction de l’apoptose. Ainsi,

les marqueurs apoptotiques communément reportés sont la modulation des protéines de la

famille Bcl-2 (Bax, Bak, Bid, Bcl-2, Bcl-xL…), la perméabilisation de la membrane

mitochondriale avec relargage du cytochrome c, l’activation des caspases 3, 8 et 9… (pour

des revues récentes voir Scherer et al. 2009 et Iciek et al. 2009). Pourtant, si le type de mort

cellulaire est assez clairement établi, le rôle que jouent les ERO dans le déclenchement de

l’apoptose reste encore contesté. De nombreuses études ont mis en évidence le lien existant

entre l’induction du stress oxydant et l’apoptose des cellules traitées par les OSCs. Par

exemple, une étude de Xiao et al. a montré que l’induction de l’apoptose de cellules de cancer

de la prostate (PC-3 et DU145) traitées par le diallyl trisulfure (DAS

) était étroitement liée à

l’augmentation du niveau intracellulaire en ERO (Xiao et al. 2004). Néanmoins, l’induction

du stress oxydant lors processus apoptotique n’est pas sytématique. En effet, il semble que la

génération de ERO soit étroitement associée au type cellulaire étudié. Ainsi, comme nous

venons de le décrire dans le cas des cellules MCF-7, Cerella et al. ont montré que l’induction

de l’apoptose des cellules U937 traitées pas DAS

est indépendante de la génération de ERO

(Cerella et al. 2009).

3 Validation de la cible pharmacologique

Au cours de ce travail, nous avons utilisé une approche inédite au laboratoire d’inhibition

post-transcriptionnelle des phosphatases CDC25. Ces expériences d’inhibition viennent en

complément des études réalisées à l’aide des deux inhibiteurs chimiques, DAS

et DPS

. En

effet, après avoir identifier les deux isoformes de CDC25 affectées par ces composés

(CDC25A et C) et étudier leurs effets cellulaires, nous avons voulu vérifier l’impact de

l’inhibition spécifique de ces deux phosphatases dans les cellules MCF-7. Dans cet objectif,

nous avons choisi d’inhiber l’activité des phosphatases CDC25A et/ou C à l’aide de petits

ARN interférents spécifiques de chaque isoforme (siRNA). Nous avons étudié les impacts

cellulaires de l’inhibition post-transcriptionnelle de CDC25A, C et A+C sur les cellules

MCF-7 en réalisant les mêmes tests que pour l’inhibition chimique (prolifération cellulaire, analyse

du cycle, induction de l’apoptose). La comparaison de ces résultats avec ceux obtenus pour

l’inhibition chimique devrait nous permettre de mieux définir la ou les cibles intracellulaires

des inhibiteurs chimiques testés.

3.1 Validation de la transfection des cellules MCF-7 par les