CHAPITRE IV. Les techniques d’études de la peau
FIGURE LEGENDS
IV. Conclusion et discussion partie 1
La peau est la première barrière qui protège l’organisme de l’environnement extérieur grâce à sa structure pluristratifiée. Lors de pathologies ou d’agressions extérieures la morphologie de la peau est modifiée. Pour prévenir et comprendre ces dommages, il est nécessaire de mieux les caractériser. Dans cet objectif, nous avons choisi d’utiliser l’explant de peau et la microscopie à feuille de lumière. Nous avons dû mettre au point une méthodologie permettant d’atteindre cet objectif.
➢ Est-il possible d’observer un explant de peau en 3D et en profondeur grâce à la
méthodologie développée ?
Nous avons mis en place une méthodologie permettant d’observer en 3D des explants de peau humaine grâce à la combinaison d’une technique de transparisation de tissu et l’utilisation de la microscopie à feuille de lumière.
Pour que la feuille de lumière traverse un échantillon opaque comme la peau, il est nécessaire de passer par une étape de transparisation. Le but est de rendre l’échantillon transparent par homogénéisation des indices de réfraction, évitant ainsi la diffusion de la lumière. Nous avons évalué plusieurs techniques de transparisation, et montré que la meilleure méthode pour la peau est celle de Murray.
Les acquisitions des différentes structures par LSFM ont montré que la couche cornée, le derme et les annexes étaient identifiables par cette technique uniquement grâce à l’autofluorescence naturelle de celle-ci. En revanche, l’épiderme ne présente pas de signal d’autofluorescence, quelle que soit la longueur d’onde d’excitation utilisée. Pour pallier à ce problème, il est possible de marquer les constituants des cellulaires tels que le cytoplasme ou les noyaux avant transparisation (Figure 30). Comme le montre cet exemple, un marquage cytoplasmique avec du CMTMR permet de mettre en évidence l’épiderme (Figure 30A, 30C). Ce type de marquage permet de délimiter facilement l’épiderme pour le segmenter et ainsi pouvoir en extraire des mesures volumiques. Un marquage nucléaire comme ici avec de l’iodure de propidium permet d’appréhender le nombre de couches épidermiques, les fibroblastes et aussi les cellules épithéliales des vaisseaux sanguins en 3D au sein de la biopsie (Figure 30B, 30D).
112 Figure 30 : Marquage cytoplasmique et nucléaire d’un explant de peau par LSFM
(A) Section optique par LSFM d’un explant de peau marqué au CMTMR (x4.5), (B) ou à l’iodure de propidium (IP, X10). Reconstruction 3D de l’épiderme après (C) marquage cytoplasmique (CMTMR) ou (D) marquage nucléaire
(IP). (Barre d’échelle 200µm)
La reconstruction 3D permet de visualiser facilement la morphologie du tissu sur tout l’échantillon. Nous pouvons ainsi évaluer l’aspect homogène (ou non) des composants de la peau comme les fibres de la matrice, les poils et les glandes sudoripares et sébacées. Les segmentations réalisées sur les rendus volumiques permettent de quantifier des volumes de certains constituants grâce aux différents contrastes de fluorescence. L’analyse d’une peau psoriasiforme avec hyperplasie illustre cet avantage (figure 6 de l’article). De plus des échantillons déjà inclus en paraffine peuvent être déparaffinés pour être visualisés par LSFM.
113 Nous pourrions donc envisager d’utiliser cette méthode, en complément de l’histologie, pour caractériser des pathologies cutanées.
Par exemple, cette méthodologie pourrait être exploitée dans le cas :
- De pathologies des annexes de la peau : En comparaison avec l’histologie, une acquisition avec le LSFM permet d’observer les glandes sébacées, par exemple, dans leur globalité. Il est alors possible de caractériser et mesurer le volume de ces annexes (Rittié et al., 2013).
- D’étude de modèle en onco-dermatologie : il serait envisageable de mesurer le volume de tumeurs présentes au sein du modèle cutané et ainsi étudier son organisation spatial dans l’ensemble du tissu.
En comparaison avec l’histologie, méthode de référence, cette méthodologie demande moins d’étapes de préparation du tissu et ne dénature pas la structure de la peau par des sections physiques. De gros échantillons peuvent être imagés, plusieurs fois, sans destruction du tissu. De plus l’échantillon peut être utilisé, après dé-transparisation, pour d’autres techniques d’imagerie. Cette méthodologie a pour avantage de pouvoir extraire des données numériques en 3D, de visualiser des coupes optiques du tissu rapidement et dans sa globalité. En revanche cette technique présente quelques limites. Avec le LSFM que nous possédons, il est difficile d’avoir des informations nettes et de bonne résolution à fort grossissement. Cet inconvénient restreint les applications de cette technique. Il est difficile de voir des dommages ou des effets de traitement au niveau de la cellule actuellement. Afin de pallier à ça, il faudrait développer la détection en 3D de protéines spécifiques afin d’aller plus loin qu’une analyse structurale du tissu. Aujourd’hui les études publiées, utilisant le LSFM pour étudier des organismes, utilisent des marquages spécifiques, souvent par immunomarquage, qui ciblent leur protéine d’intérêt, permettant ainsi d’approfondir l’utilisation de cette microscopie (Belle et al., 2017; Li et al., 2017).
➢ Cette méthodologie est-elle adaptée pour évaluer les effets des agressions
extérieures ?
Nous avons voulu évaluer si cette méthodologie était applicable à l’observation de dommages extérieurs appliqués sur la peau. Nous avons choisi d’étudier les effets d’une brûlure à l’eau bouillante, d’un détergent et d’une irradiation aux UVB et aux UVA sur des explants.
Les observations réalisées, ont montré qu’une brûlure à l’eau bouillante entraine une augmentation des crêtes épidermiques et un aplatissement de la jonction dermo-épidermique.
114 L’exposition au SDS induit une détérioration de la couche cornée. L’irradiation aux UVB semble quand a elle provoquer une modification de l’épaisseur de l’épiderme.
Si celle-ci sont minimes ou au niveau cellulaire, comme dans le cas de notre protocole d’irradiation aux UVA, aucun effet n’a été observé par microscopie à feuille de lumière.
Dans le cas de la brûlure à l’eau bouillante, l’utilisation d’un modèle cutané semble induire un biais. In vivo suite à une brûlure, l’épaisseur de la peau est plutôt diminuée et le macro-relief lissé. Ici nous observons l’inverse. Sous l’effet de la chaleur l’épiderme de la biopsie semble s’être rétracté sur lui-même et par conséquent avoir étiré la jonction dermo-épidermique et entrainé un l’allongement des noyaux. Ce phénomène est ici possible car la peau n’est pas maintenue au sein d’un tissu et donc sous tension. L’analyse histologique montre que le phénotype observé semble ressembler à une brûlure électrique (Torre and Cardellini, 1980). De manière générale l’observation en 3D permet d’explorer sur tout l’échantillon, rapidement, des altérations morphologiques importantes et de mesurer le volume de certaines structures.
En conclusion nous avons montré que la méthodologie d’imagerie que nous avons développée (Figure 31) permet d’observer des modifications tissulaires importantes avec une visualisation en 3D et ainsi étudier et quantifier des paramètres sur une peau saine, pathologique ou endommagée.
115 Figure 31 : Méthodologie d’acquisition par LSFM pour observer la peau humaine
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