Conclusion

Caractérisation des surfaces et des objets

6

Méthodes d’observation et mise en place de l’écoulement de cisaillement.

Méthodes d’observation et mise en place de l’écoulement de cisaillement.

Nos diverses expériences montrent que nous arrivons à greffer des histidines sur une

sur-face. En effet, l’incubation de nickel fluorescent sur une surface recouverte d’histidine rend

la surface fluorescente. On a proposé une nouvelle approche de caractérisation de surface

F

. 5.10 – Vésicules électroformées avec 20 % de lipide NTA-Ni et billes d’agarose

chéla-tantes rendues fluorescentes par reconnaissance spécifique entre le nickel et les histidines du

peptide modifié.

F

. 5.11 – Intensité de fluorescence de vésicules recouvertes de nickel et incubées dans une

solution de AV20KH-FITC. La fluorescence représentée est la différence entre la

fluores-cence mesurée au centre de la vésicule et la fluoresfluores-cence mesurée en dehors de la vésicule.

qui utilise la FCS, qu’on n’a pas eu le temps de développer pour avoir des résultats

quanti-tatifs. Enfin, les vésicules et les billes sont rendues fluorescentes par une chélation (et donc

une reconnaissance spécifique) entre le nickel des billes se trouvant sur une surface et des

histidines se trouvant, elles, en solution.

Chapitre

6

Méthodes d’observation et mise en place de

l’écoulement de cisaillement.

Ce chapitre est consacré aux techniques générales utilisées au cours de l’étude de nos

objets. Nous expliciterons dans un premier temps les deux principales techniques de

micro-scopie utilisées (la micromicro-scopie à contraste de phase et à contraste interférentiel), puis nous

passerons en revue les différentes chambres d’écoulement utilisées avant d’exposer les aspects

de vidéo microscopie, de traitements d’image.

6.1 Les différentes techniques de microscopie utilisées

Un microscope à fond clair permet d’observer les objets qui constituent l’échantillon

car ces derniers modifient l’intensité, par exemple par absorption. Il est alors aisé

d’ima-ger en fond clair des particules absorbant fortement la lumière lorsqu’elles sont plongées

dans un solvant (l’eau) qui absorbe peu. Le profil des particules se détache dans ce cas sur

l’image formée par le microscope. On parle d’objets d’amplitude car ces objets modifient

nettement l’amplitude de l’onde électromagnétique (photons) qui les traverse. Certains

ob-jets modifient peu l’amplitude de l’onde, i.e. la transmission de l’échantillon est la même en

tout point et l’indice optique varie peu. Cependant, si l’amplitude de l’onde est peu altérée

par les objets de l’échantillon, la phase de l’onde est beaucoup plus sensible aux variations

d’indice. C’est cette propriété qui est utilisée dans la microscopie à contraste de phase.

6.1.1 Le microscope à contraste de phase

Le principe d’un microscope à contraste de phase est présenté sur la figure 6.1 et il

consiste à introduire un déphasage de π/2 sur l’onde directe afin que l’intensité dépende

directement de la phase et donc de l’indice optique du milieu traversé.

F

. 6.1 – Principe de la microscopie à contraste de phase.

Pour cela, on place une lame quart d’onde que l’on appelle anneau de phase dans le

plan conjugué du diaphragme annulaire. Cette lame quart d’onde est montée à l’intérieur

de l’objectif. Ainsi on ne déphase que la lumière incidente et pas la lumière diffusée par

l’échantillon. En faisant varier la phase de l’onde, on fait alors varier son amplitude et donc

l’intensité. Le principal avantage de la microscopie à contraste de phase est de permettre la

visualisation rapide et précise des vésicules : elles apparaissent en noir sur un fond plus clair

(6.2) et entourées d’un halo lumineux blanc. Le sucrose interne et le glucose externe n’ayant

pas le même indice optique, leurs phases sont différentes. De plus, la microscopie à contraste

de phase permet de vérifier que la vésicule renferme toujours sa solution interne.

F

. 6.2 – Vésicules renfermant une solution de sucrose, suspendues dans une solution de

glucose de même osmolarité observées par microscopie à contraste de phase

6.1.2 La microscopie à contraste interférentiel en réflexion : RICM

La microscopie par contraste interférentiel en réflexion (RICM) permet d’observer et de

caractériser des films minces. Soit une vésicule au voisinage d’une lame de verre éclairée par

une source de lumière monochromatique de longueur d’onde λ =546 nm. Si la distance

vésicule/paroi est suffisamment faible, de l’ordre de grandeur de la longueur d’onde de la

lumière, les réflexions successives sur la lame de verre I

et sur la vésicule I

vont conduire

à des interférences (figure 6.3). La position et le contraste des interférences permettent de

remonter à la distance séparant la vésicule de la lame de façon très précise, ainsi qu’au profil

de la vésiculeh(x)[Rädler and Sackmann, 1993]. Ainsi, l’intensité obtenue dépend de h(x)

selon la relation suivante :

I(h(x)) =I

+I

+2ÆI

I

cos



2πh(x)

i



(6.1)

aveci=λ/2n

, l’interfrange,n

est l’indice de réfraction du milieu.

Pour des objets réfléchissant très peu la lumière, il est nécessaire de s’affranchir de toute

+2^ÆI

h(x) = ^λ