Os oito métodos empregados para a extração de EPS foram avaliados quanto a diferenças na quantidade de polímeros extraídos. Para isso foram quantificados carboidratos e proteínas, os quais constituem a grande maioria dos biopolímeros formadores da matriz extracelular de biofilmes, tanto aeróbios quanto anaeróbios. Para a quantificação de carboidratos foi empregado o método de Dubois (DUBOIS et al., 1956), o qual mostra-se efetivo para a quantificação de EPS e SMP de reatores e amostras naturais (AQUINO e STUCKEY, 2004; COMTE et al., 2007; D’ABZAC et al., 2010).
Por outro lado, para a quantificação de proteínas existem grandes divergências acerca do uso de protocolos de quantificação de uso já consolidado em outras áreas, como o método de Lowry (LOWRY et al., 1951; FRØLUND et al., 1995). A principal razão para isso é a interação entre outros compostos e o reagente de Folin-Ciocalciteau, usado na reação de Lowry. Entre os principais compostos interferentes, estão as substâncias húmicas presentes em grandes quantidades em amostras de solo e grânulos anaeróbios (BASTIDA et al., 2009; D’ABZAC et al., 2010). Frolund e colaboradores (1995) reportaram que a concentração proteica em amostras desse tipo pode ser superestimada em até 40%, quando usado o método de Lowry convencional. Para contornar o problema, os autores desenvolveram um método baseado em duas medições, uma delas feita sem alterações e outra sem a adição de Cu2SO4.
Como o sulfato de cobre é o responsável por intensificar a coloração apresentada por proteínas no método de Lowry, aferições feitas na ausência do sal servem como medida da quantidade de ácidos húmicos presentes na amostra. Após correção matemática das absorbâncias tomadas em ambas as medições, tem-se um valor mais aproximado da concentração proteica das amostras. Desse modo, nesse trabalho adotou-se o método de Frolund (FRØLUND et al., 1995) para a quantificação proteica.
Como pode ser visto na figura 8, cada método de extração solubilizou quantidades distintas de polímeros. Apesar de alguns autores levarem em conta apenas variações quantitativas para a escolha de um método de extração (FROLUND et al., 1996;
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DOMÍNGUEZ et al., 2010), é importante ressaltar que a escolha de um único método não fornece informações representativas de todo o complexo de polímeros que forma os EPS (PARK e NOVAK, 2007).
Figura 8: Concentração de proteínas (barras pretas) e carboidratos (barras cinzas) para cada método de extração. Os números acima das barras indicam a razão proteína/carboidratos.
No presente estudo, o método que solubilizou maiores quantidades de polímeros totais foi o que fez uso de hidróxido de sódio (base e formol+base, figura 8). Segundo Sheng e colaboradores (2010) a adição de NaOH causa o desprendimento dos EPS devido à remoção dos hidrogênios ionizáveis de grupos carboxílicos, aumentando a força de repulsão entre células e EPS. Somada a essa capacidade, a elevação do pH aumenta a solubilidade do alumínio em água. Como mostrado por Park e Novak (2007), esse metal auxilia na estruturação da matriz extracelular e, com sua solubilização ocorreria a simultânea liberação de EPS. A união desses dois mecanismos resulta na alta eficiência apresentada pelo método.
De maneira interessante, o tratamento prévio das amostras com formaldeído reduziu o rendimento das extrações por NaOH. Esse fenômeno foi observado também para a extração por aquecimento. Liu e Fang (2002) supõem que o HCOH, devido sua capacidade de fixação das células, tenha ação protetora sobre a membrana celular dos micro-organismos, diminuindo
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a lise causada durante as extrações. Apesar de os métodos não causarem danos às células, pelo menos nas condições em que foram realizados, a ocorrência de lise celular não pode ser descartada (GARCÍA BECERRA et al., 2010; LI e YANG, 2007). Em contrapartida, alguns trabalhos mostram que, por si só, a adição de formaldeído pode solubilizar exopolímeros (ZHANG et al., 1999). Possivelmente, a complexação com formaldeído, tornou parte dos carboidratos e proteínas menos susceptíveis a ação dos outros agentes de extração (FOX et
al., 1985).
Dois dos métodos, CER e EDTA, são baseados na desestabilização dos EPS por meio da remoção de cátions estabilizadores da matriz. Enquanto a resina de troca catiônica sequestra íons Mg2+ e Ca2+, o EDTA, além desses, pode quelar também íons Fe2+/3+ (WU e XI, 2009). A despeito dessa maior abrangência do EDTA, a resina de troca catiônica apresentou melhores resultados, principalmente em relação à quantidade de proteínas liberadas. Possivelmente, isso se deve ao fato de que a resina, além de suas propriedades quelantes, substitui os cátions divalentes por íons Na+. Como mostrado por Arabi e Nakhla (2009a), altas concentrações de sódio estão relacionadas à diminuição da quantidade total de EPS com consequente aumento dos polímeros solúveis em reatores de membrana.
Outro método baseado na remoção de cátions estabilizadores é o que faz uso de Na2S.
Segundo Nielsen e Keiding (1998), em ensaios com lodo ativado, a adição de sulfeto de sódio remove íons Fe2+/3+ pela formação de FeS, resultando na desintegração dos flocos. Em nosso trabalho, a adição de Na2S solubilizou aproximadamente a mesma quantidade de polímeros
obtida com a CER. Segundo Park e Novak (2007), os polímeros extraídos por cada um desses dois métodos podem ser considerados como diferentes frações de EPS. Portanto, levando em conta a soma dessas frações, nossos dados indicam que grande parte dos EPS de grânulos anaeróbios é estabilizada pela interação com cátions di e trivalentes. Visto que tanto a concentração quanto a razão entre esses íons podem alterar características do lodo, como tamanho e hidrofobicidade, o monitoramento desses em águas residuárias que chegam a estações de tratamento pode auxiliar no desempenho de reatores anaeróbios (ARABI e NAKHLA, 2009a,b).
Entre os métodos físicos de extração, o aquecimento foi mais eficiente do que a centrifugação. Essa diferença era esperada, visto que o desprendimento de polímeros devido à força centrífuga é pequeno, em razão da baixa agressividade da técnica (ADAV e LEE, 2011). A aceleração do movimento das partículas gerada pelo aumento da temperatura (SHENG et
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al., 2010), por outro lado, liberou uma quantidade de polímeros comparável ao método químico mais eficiente (NaOH).
Nesse trabalho, a razão proteínas/carboidratos foi na maioria das vezes, exceto para os métodos formaldeído + aquecimento e EDTA, maior do que um. A prevalência de proteínas e peptídeos sobre demais polímeros dos EPS já foi demonstrada em outros trabalhos com culturas mistas (SHENG et al., 2006). Por outro lado, em culturas microbianas puras o biofilme seria formado quase que em sua totalidade por carboidratos (FLEMMING e WINGENDER, 2010). Essas discrepâncias fizeram com que, nos primeiros trabalhos sobre a composição dos EPS de comunidades mistas, a presença de proteínas em extratos fosse usada como um indicador da lise de células durante o processo de extração. Posteriormente, análises da atividade de enzimas intracelulares ou da quantidade de DNA liberado em solução mostraram que extratos de EPS contendo grande quantidade de proteínas, não necessariamente estão relacionados à lise celular, atribuindo um importante papel das proteínas na composição de biofilmes naturais (NIELSEN e JAHN, 1999). Desta forma é possível que, assim como em biofilmes naturais, as proteínas desempenhem papel importante na agregação e formação de lodo anaeróbio aplicado ao tratamento de esgoto doméstico, tal como o utilizado neste trabalho.