Conception de ligands peptidiques du hPPARα

Le PPARα ne disposant d'aucun ligand peptidique connu, la première étape a été la conception d'un hit virtuel potentiel. Ce dernier est un peptide qui n'a pas été testé expérimentalement et dont nous ne savons donc pas s'il est actif ou pas. Cependant, son mode d'interaction prédit in silico par EADock est bien défini et reproductible. Il peut donc être utilisé comme point de départ de l'optimisation de séquence. L'analyse des ligands organiques synthétiques montre qu'ils ont en commun un certain nombre de caractéristiques : ils possèdent une tête polaire (généralement une fonction carboxylate ou un cycle thiazolidinedione), interagissant avec la partie polaire du site actif (Ser280, Tyr314, His440 et Tyr464), ainsi qu'une longue queue hydrophobe qui fait des interactions de van der Waals avec le reste du site actif, lui-même hydrophobe [137]. Le hit peptidique virtuel potentiel que nous avons choisi sur cette base a la séquence ADAAA. Ce peptide été positionné dans le site actif de hPPARα par EADock. Le mode d'interaction observé était celui attendu, avec la chaîne latérale de l'aspartate participant à un réseau de 4 liaisons hydrogène, et les alanines remplissant la partie hydrophobe de site actif (voir Figure 18).

Deux cycles d'optimisation ont été réalisés à partir du hit peptidique virtuel potentiel ADAAA. Les cartes d'interactions favorables réalisées n'ont suggéré aucune mutation pour l'alanine N-terminale. L'aspartate en position 2 pourrait être remplacé par un glutamate, et une mutation de l'alanine en position 3 vers la serine pourrait permettre la création d'une liaison hydrogène supplémentaire avec la chaîne latérale de la Ser280. L'espace disponible autour de l'alanine en position 4 est très réduit, et aucune mutation n'a donc pu être proposée. Enfin, l'alanine C-terminale semblerait pouvoir être remplacée par un acide aminé hydrophobe. La Figure 19 illustre quelques positions favorables de la chaîne latérale du tryptophane, dont une pouvant être liée au reste du peptide et faisant des interactions de van der Waals favorables avec Cys275, Val332 et Ala333), ainsi qu'une interaction π- π avec la chaîne latérale de Tyr334 (T-stacking).

L'affinité de plusieurs peptides a été réalisée expérimentalement.

Figure 18 : Mode d'interaction calculé pour le ligand potentiel virtuel ADAAA. La fonction carboxylate de l'aspartate participe à un réseau de liaisons hydrogène avec Ser280, Tyr314, His440 et Tyr464.

His440

Ser280

Aucune activité détectable n'a pu être mise en évidence pour ADAAA. Bien que surprenant, ce résultat est intéressant car il confirme qu'il n'est pas nécessaire qu'un ligand ait une activité détectable pour alimenter le cycle d'optimisation de séquence, dès lors que son mode d'interaction prédit in silico est bien défini et reproductible. Nos résultats préliminaires montrent que l'un des peptides a une activité similaire à celle du ligand organique Wy 14,643. Ces premiers résultats sont très encourageants au regard de l'absence de point de départ expérimental de l'optimisation, et en gardant à l'esprit que l'optimisation de séquence s'est faite intégralement in silico, montrant ainsi l'intérêt clair de ces méthodes dans la conception de nouvelles molécules actives.

Figure 20 : (A) Mode d'interaction calculé pour un peptide donné (boule/bâton) dans PPARα. La surface de la protéine est coupée afin de montrer le remplissage de son site actif par le peptide. (B) Réseau de liaisons hydrogène impliquant la chaîne latérale du glutamate de ESAW ainsi que Ser280, Tyr314, His440 et Tyr464.

His440 Tyr464

Tyr314 Ser280

Figure 19 : (A) Mode d'interaction calculé pour un peptide template (boule/bâton). Les acides aminés N et C terminaux ne sont pas représentés par souci de clarté. Les positions favorables de la chaîne latérale du tryptophane sont représentées par de fines lignes vertes, sauf celle permettant une reconnexion avec le reste du peptide par l'intermédiaire de son acide aminé C-terminal. (B) Mode d'interaction calculé pour le peptide modifié. La chaîne latérale du tryptophane est colorée en vert.

Cys275

Tyr334 Val332

6.4.4 Conclusion

L'approche basée sur des fragments utilisée dans ce travail a conduit à plusieurs tétrapeptides et pentapeptides dont certains ont montré une activité sur le PPARα détectable expérimentalement. L'activité mesurée du de l'une des molécules testées est similaire à celle du Wy14,643, ligand organique bien connu de PPARα.

D'autres cycles d'optimisation de séquence vont être réalisés afin d'améliorer encore l'affinité de ces peptides. Plusieurs modifications peuvent être envisagées afin de limiter leurs sensibilités aux protéases, comme l'introduction d'acides aminés D dans leurs séquences.

7 Conclusion

Les approches théoriques permettant la prédiction du mode d'interaction d'un ligand avec son récepteur sont complémentaires des expériences in vitro et in vivo, et permettent parfois leur interprétation. Elles donnent un éclairage irremplaçable sur les interactions au niveau moléculaire et sont, de ce fait, le socle à partir duquel une conception ou une optimisation rationnelle de molécules actives, prenant en compte des critères structuraux, peut être envisagée. De plus, elles permettent de réduire significativement les expériences in vitro en focalisant la recherche sur une petite fraction intéressante d'une base de données de molécules par ailleurs trop volumineuse pour être explorée expérimentalement. Les données expérimentales sont néanmoins absolument nécessaires au développement des outils théoriques et à leurs validations. Cette synergie entre les approches théoriques et expérimentales est cruciale pour une évolution optimale des connaissances en biologie, pharmacie et médecine. Un tel environnement de recherche est très certainement l'une des clés vers un chemin de plus en plus plus court entre l'identification d'un besoin thérapeutique à la délivrance du médicament ad hoc au patient.

THÈSE SOUTENUE PAR : AURÉLIEN GROSDIDIER

TITRE : Conception d'un logiciel de docking et applications dans la recherche de nouvelles molécules actives.

CONCLUSION

Les récentes difficultés de l'industrie pharmaceutique ne semblent pouvoir se résoudre que par l'optimisation de leur processus de développement de médicaments. Cette dernière implique de plus en plus de techniques dites “haut-débit”, particulièrement efficaces lorsqu'elles sont couplées aux outils informatiques permettant de gérer la masse de données produite. Désormais, les approches in silico telles que le criblage virtuel ou la conception rationnelle de nouvelles molécules actives sont utilisées couramment. Toutes deux reposent sur la capacité à prédire les détails de l'interaction moléculaire entre une molécule ressemblant à un principe actif (PA) et une protéine cible ayant un intérêt thérapeutique. Les comparatifs de logiciels s'attaquant à cette prédiction sont flatteurs, mais plusieurs problèmes subsistent. La littérature récente tend à remettre en cause leur fiabilité, affirmant l'émergence d'un besoin pour des approches plus précises du mode d'interaction. Cette précision est essentielle au calcul de l'énergie libre de liaison, qui est directement liée à l'affinité du PA potentiel à la protéine cible, et indirectement liée à son activité biologique. Une prédiction précise est d'une importance toute particulière pour la découverte et l'optimisation de nouvelles molécules actives.

Cette thèse présente un nouveau logiciel, EADock, mettant en avant une telle précision. Cet algorithme évolutionnaire hybride utilise deux pressions de sélections, combinées à une gestion de la diversité sophistiquée. EADock repose sur CHARMM pour les calculs d'énergie et la gestion des coordonnées atomiques. Sa validation a été effectuée sur 37 complexes protéine-ligand cristallisés, incluant 11 protéines différentes. L'espace de recherche a été étendu à une sphère de 15 Å de rayon autour du centre de masse du ligand cristallisé, et contrairement aux comparatifs habituels, l'algorithme est parti de solutions déjà optimisées et présentant un RMSD jusqu'à 10 Å par rapport à la structure cristalline. Cette validation a permis de mettre en évidence l'efficacité de notre heuristique de recherche car des modes d'interactions présentant un RMSD inférieur à 2 Å par rapport à la structure cristalline ont été classés premier pour 68% des complexes. Lorsque les cinq meilleures solutions sont prises en compte, le taux de succès grimpe à 78%, et 92% lorsque la totalité de la dernière génération est prise en compte. La plupart des erreurs de prédiction sont imputables à la présence de contacts cristallins.

Depuis, EADock a été utilisé pour comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la Na,K- ATPase et dans l'activation du peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα). Il a également permis de décrire l'interaction de polluants couramment rencontrés sur PPARγ, ainsi que l'influence de la métabolisation de l'Imatinib (PA anticancéreux) sur la fixation à la kinase BCR-ABL. Une approche basée sur la prédiction des interactions de fragments moléculaires avec protéine cible est également proposée. Elle a permis la découverte de nouveaux ligands peptidiques de PPARα et de l'intégrine α5β1. Dans les deux cas, l'activité de ces nouveaux peptides est comparable à celles de ligands bien établis, comme le Wy14,643 pour le premier, et le Cilengitide (PA anticancéreux) pour la seconde.

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