RESUMO
A busca por tecnologia que auxiliem para o desenvolvimento de uma agricultura com menos uso de agrotóxicos ou ajudem os produtores orgânicos é cada vez maior. Assim, a ativação das defesas naturais das plantas, denominada de resistência sistêmica adquirida (RSA) vêm apresentado destaques no meio cientifico, pelo seu mecanismo de ação no controle de patógenos, bem como na possibilidade de utilizar produtos alternativos bióticos ou abióticos como indutores de resistência. Dessa forma avaliou-se com este trabalho o potencial de extratos vegetais de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Braccharis trimera) e nim (Azadirachta indica), aplicados em pós-colheita de pêssegos no processo de indução de resistência e no controle de podridão parda. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições de 7 frutos. Os frutos, sem lesões e sem sintomas de podridão parda, foram colhidos, desinfestados e secos a temperatura ambiente. Os extratos foram preparados, na concentração de 20%, utilizando-se 20 g do material vegetal para 100 mL de água destilada, triturado e peneirado. Os frutos foram mergulhados nos extratos por 30 min, em seguida armazenados em BOD a 25 ºC, fotoperíodo de 12 h, por 24 h. Após esse período foi inoculado M. fructicola na concentração 2x105 esporos mL-1, em todos
os lados do fruto, com auxílio de borrifador. Depois da inoculação, os frutos permaneceram em condições controladas e em intervalos de 24, 48 e 72 h, em amostras de frutos, coletou-se material vegetal (epicarpo e mesocarpo) para utilização nas análises bioquímicas. Foram realizadas a mensuração do teor de proteínas totais, açúcares totais e redutores, atividade das enzimas fenilalanina amônia-liase (FAL), β 1,3 glucanase e quitinase. Ainda, avaliou-se os níveis de podridões dos frutos. Os resultados demonstraram que os extratos avaliados, possuem potencial de induzir a resistência dos frutos à podridão parda, ativando as enzimas quitinase e fenilalanina amônia-liase. No entanto, o extrato de alho, além de demonstrar destacável potencial de ativar tais mecanismos de defesa, atua na redução da podridão de frutos de pêssego causada por M. fructicola.
Palavras-chave: Eliciadores. Monilinia fructicola. Indução de resistência sistêmica adquirida.
ABSTRACT
The search for technology to assist in the development of agriculture with less use of pesticides or help organic farmers is growing. Thus, activation of natural defenses of plants, called systemic acquired resistance (SAR) are presented highlights in the scientific environment, for its efficiency in the control of pathogens and the possibility of using biotic
or abiotic alternative products such as resistance inducers. Thus we evaluated this work the potential of plant garlic extract (Allium sativum), rue (Ruta graveolens), coot (trimera
Braccharis) and neem (Azadirachta indica), applied post-harvest peaches in the induction
process resistance and control of brown rot. The experimental design was completely randomized with four replications of 7 fruits. The fruits, without injuries and symptoms of brown rot were collected, disinfected and dried at room temperature. The extracts were prepared at a concentration of 20%, using 20 g plant material per 100 mL of distilled water, ground and sieved. The fruits were immersed in the extracts for 30 min then stored in BOD at 25 ° C, 12 h photoperiod for 24 h. After this period was inoculated M. fructicola at
concentration 2x105 spores mL-1 on all sides of the fruit, with the aid of spray. After
inoculation, fruits were under controlled conditions and at intervals of 24, 48 and 72 h in fruit samples collected up plant material (epicarp and mesocarp) for use in biochemical analysis. They were carried out to measure the content of total protein, total and reducing sugars, activity of enzymes phenylalanine ammonia-lyase (PAL), β 1,3 glucanase and chitinase. Furthermore, we assessed the levels of fruit rots. The results showed that the extracts evaluated, have the potential to induce resistance to brown rot of fruits, activating the chitinase enzymes and phenylalanine ammonia lyase. However, the garlic extract, besides demonstrating detachable potential to activate such defense mechanisms, works to reduce the peach fruit rot caused by M. fructicola.
Keywords: Elicitors. Monilinia fructicola. Induction of systemic resistance acquired.
4.1 INTRODUÇÃO
Dentre as espécies de frutas de caroço o pêssego (Prunus persica L.) é a de maior importância econômica mundial, além de ser muito pesquisada sua adaptação às condições de clima subtropical (ZANETTE; BIASI, 2004). Porém devido as condições de alta umidade e calor, surgem doenças, como a podridão parda (Monilinia fructicola (Wint.) Honey), que causa elevados danos econômicos, pois desenvolve-se principalmente na pós-colheita dos frutos. Segundo Danner et al. (2008) não existe cultivares totalmente resistente à essa doença, sendo seu controle realizado principalmente por fungicidas químicos, muitas vezes sem sucesso no controle do patógeno. Por isso torna-se necessário pesquisas que auxiliem em métodos alternativos de controle, para que haja diminuição no uso de fungicidas sintéticos na cultura e também auxilie os produtores de frutos orgânicos.
Dessa forma a aplicação de produtos alterativos, que desencadeiam a indução da resistência, é uma das formas promissoras no controle de fitopatógenos, sendo uma tecnologia de baixo custo e fácil utilização pelos agricultores. Para isso aplica-se nas plantas eliciadores de origem biótica ou abiótica que induzem a expressão de genes que codificam diversas respostas de defesa a patógenos (DURRANT; DONG, 2004). À medida que a planta passa a reconhecer as variações advindas de sinais exógenos produzidos pelo patógeno, ocorre a
transdução destes levando a uma reprogramação do metabolismo da célula vegetal, fazendo com que este expresse resistência (PASCHOLATI, 2011).
A resistência sistêmica adquirida (RSA) geralmente é ativada por patógenos necrotróficos, dependente do acúmulo de ácido salicílico (AS) e da proteína de regulação NPR1, porém o efeito protetor depende do indutor e da planta, podendo variar de poucos dias até o final do ciclo da planta (PASCHOLATI, 2011). O acúmulo do ácido salicílico aumenta a proteção da planta, ativando a síntese de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas-RP), como quitinases e β-1,3-glucanase, além do aumento da expressão da enzima fenilalanina amônia-liase (FAL), que está diretamente ligada a síntese de compostos fenólicos e deposição de lignina (DURRANT; DONG, 2004).
Segundo Schwan-Estrada et al. (2012) as plantas apresentam substâncias que demonstram alguma atividade sobre o metabolismo de um organismo vivo, ou seja, induz ou ativa os mecanismos de defesa da planta. Assim os extratos vegetais possuem ação como indutores de resistência, elevando a produção de PR-proteínas e compostos fenólicos que indicam substâncias com características eliciadoras, aumentando a defesa da planta (ALVES; PERINA, 2014).
Porém escassos são os trabalhos que relacionaram à indução da RSA utilizando extratos na pós-colheita, principalmente em pêssegos que apresentam grande perecibilidade. Diante disso objetivou-se com o trabalho avaliar a indução de resistência sistêmica adquirida à podridão parda em pêssegos, utilizando extratos vegetais de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Braccharis trimera) e nim (Azadirachta indica), aplicados em pós-colheita dos frutos.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi desenvolvido nos Laboratórios de Microbiologia da Universidade Federal Fronteira Sul (UFFS) – Campus Erechim e de Fitopatologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) – Campus Dois Vizinhos. Os pêssegos utilizados foram da cultivar Granada, provenientes de produtor da região de Floriano Peixoto, RS. O pomar possui oito anos, com condução tipo taça e espaçamento de 4x6 m. Aplicou-se o fungicida Captan (240 g 100 L-1 de água) no início da frutificação. O delineamento
experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com quatro repetições, contendo 7 frutos em cada repetição.
Os extratos utilizados foram obtidos a partir de bulbilhos de alho (Allium sativum), folhas secas de nim (Azadirachta indica), parte aérea de arruda (Ruta graveolens) e carqueja (Braccharis trimera). Essas duas últimas plantas foram colhidas na fase vegetativa, durante as primeiras horas do dia.
Para a obtenção dos extratos aquosos, utilizou-se 20 g do material vegetal para 100 mL de água destilada. Este foi triturado em liquidificador industrial, por 3 vezes consecutivas, durante 5 min em intervalo de 3 min. Após, os extratos foram deixados em repouso por 24 h, posteriormente peneirados e passado em gaze até não sobrar resíduos de partes vegetais. Foram armazenados em embalagem plástica e envoltos por papel pardo, devidamente identificado.
Os frutos, sem lesões e sem sintomas de podridão parda, foram colhidos e alocados em caixas plásticas, transportados até o laboratório da UFFS, desinfestados com hipoclorito de sódio a 1% e três lavagens sucessivas com água destilada. Após colocados sobre papel toalha e deixados secar por 10 min a temperatura ambiente.
Em seguida os frutos foram mergulhados nos extratos por 30 min, retirados e colocados sobre papel toalha para que houvesse o escorrimento do excesso, após foram dispostos sobre bandejas de plástico forradas com papel toalha e armazenados em BOD a 25 ºC, com fotoperíodo de 12 h, por 24 h.
Após esse período foi inoculado M. fructicola na concentração 2x105 esporos mL-1, em
todo o fruto, com auxílio de borrifador. A cultura pura foi obtida em meio Batata-Dextrose- Ágar (BDA) a partir de frutos infectados. Esta foi mantida em BOD, a 25 ºC, fotoperíodo de 12 h, durante 15 dias. Adicionou-se sobre a cultura 10 mL de água de destilada e com o auxílio da alça de Drigalski efetuou-se a raspagem das colônias, que foram coadas em gaze dupla e efetuou-se a contagem de esporos na câmara de Neubauer.
Posteriormente a inoculação do fungo os frutos permaneceram em condições controladas e após 24, 48 e 72 h, determinou-se a incidência de podridão parda, pelo percentual de frutos que desenvolveram a doença em relação ao total de frutos avaliados em cada período.
Para as análises bioquímicas após 24, 48 e 72 h a aplicação de M. fructicola seccio- nou-se amostras do fruto (epicarpo e mesocarpo) com aproximadamente 1 cm² e 0,5 cm de profundidade cortados com estilete, identificados e armazenados no Ultra freezer (-80 ºC) até o momento do uso.
Para a preparação dos extratos enzimáticos utilizou-se 1 g da amostra do fruto, corres- pondente a cada tratamento, macerado mecanicamente em almofariz com 0,5 g de micropéro- las de vidro, 0,3 g de resina Dowex®1-x8, e 1,5 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP). Adicio-
nou-se 10 mL de tampão borato de sódio 0,1 M, pH 8,8, contendo 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT e ácido ascórbico 50 mM. Os extratos foram centrifugados a 14000 rpm por 30 min a 4 °C (GUZZO; MARTINS, 1996). Os sobrenadantes foram utilizados para avaliar o teor de pro- teínas, atividade da quitinase, β-1,3-glucanase e FAL.
O teor de proteínas foi determinado pelo teste de Bradford (1976), utilizando-se 40 µL do sobrenadante, 460 µL de água destilada e 1 mL do reagente Bio-Rad® (1/4), agitado em
vortex, e após realizado a leitura em espectrofotômetro a 595 nm.
A concentração de açúcares totais foi determinado pelo método fenol-sulfúrico, con- forme Miller (1959), adicionando-se 20 µL de sobrenadante, 480 µL de tampão fosfato, 0,5 mL de fenol 5% e 2,5 mL de ácido sulfúrico, absorbância em espectrofotômetro 490 nm (DU- BOIS et al., 1956). Enquanto que para a concentração de açúcares redutores utilizou-se 5 mL de sobrenadante, 1 mL de DNS, agitou-se em vortex, colocou-se em banho-maria por 5 min, depois de frio completou-se com 10 mL de água destilada e leitura em espectrofotômetro 540 nm.
Para dose das atividades de quitinases e β-1,3-glucanase seguiu-se os procedimentos descritos por Wirth e Wolf (1990), com adequações, sendo que as amostras foram maceradas em 2,0 mL de tampão acetato 50 mM (pH 5,0), com posterior centrifugação (20.000 g por 25 min, a 4 °C). O sobrenadante foi coletado e utilizado para a avaliação da atividade das enzi- mas.
A atividade enzimática da quitinase foi avaliada através da liberação de oligômeros so- lúveis de “chitin-azure”, a partir de quitina carboximetilada marcada com remazol brilhante violeta 5R -RBV (Sigma Aldrich®), absorbância em espectrofotômetro a 595 nm. Para deter-
minação espectrofotométrica das atividades de β-1,3-glucanase nos extratos foi utilizado como substrato curdlan-remazol azul brilhante (Sigma Aldrich® - 4 mg mL-1), leitura a 600
nm.
A determinação da enzima fenilalanina amônia-liase foi avaliado com base na diferen- ça de absorbância resultante da conversão da fenilalanina em ácido trans-cinâmico. Utili- zou-se 1,5 mL do extrato enzimático, acrescentou 1,0 mL do tampão de extração e 0,5 mL de fenilalanina (49,6 mg mL-1). A mistura foi incubada por 1 hora a 40 °C, interrompendo-se a reação com banho de gelo e reali-
Os dados foram submetidos à análise de variância e quando significativos, a comparação das médias foi realizada pelo teste de Tukey, a 5% de significância, com uso do programa ASSISTAT 7.7 (SILVA; AZEVEDO, 2002).
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A utilização dos extratos vegetais demonstraram eficiência no controle da incidência da podridão parda nos pêssegos, principalmente o extrato de alho que obteve a menor infecção nos frutos em todo o período de análise diferenciando-se dos demais extratos que não diferiram da testemunha (Figura 3). Ainda o extrato arruda obteve o mesmo desempenho do alho 24 h após a inoculação do fungo, sendo que o extrato de alho e arruda inibiram 89 e 82%, respectivamente, o desenvolvimento da doença em relação à testemunha.
O resultado obtido com o extrato de alho na redução da incidência da podridão parda pode ser devido a ativação de rotas metabólica de defesa vegetal, como a ativação das proteínas relacionadas à patogenicidade, a quitinase, observada sua expressão nesse trabalho. (Tabela 7). Bem como, a possibilidade de sua ação direta sobre o patógeno, observado em estudo complementar a esse trabalho.
Figura 3 - Incidência (%) de podridão parda em pêssegos tratados em pós-colheita com extrato aquoso de alho, arruda, carqueja e nim em função do tempo de avaliação. UFFS, Erechim/RS, 2016. Tempo (horas) 24 24 24 24 48484848 72727272 % I n ci d ê n ci a d e p o d ri d ã o 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Testemunha Alho Arruda Carqueja Nim
As análises bioquímicas demonstraram efeito dos extratos vegetais aquosos no aumento dos teores de açúcares totais e redutores, porém essa atividade não apresentou significância estatística. Os valores médios de açúcares totais e redutores observados foram 74,7 mg g-1 tecido e 1,3x10-3 mg g-1 tecido, sendo valores que encontram-se dentro de
parâmetros normais para cultura. Enquanto que para os teores de proteínas os extratos de carqueja, nim, alho e arruda obtiveram maior concentração 24 h após a inoculação de M. fructicola, observando que nesse período alcançaram teores de 82,84, 79,31, 77,68 e 68,76%, respectivamente, acima da testemunha, porém esses teores diminuíram com o passar do período de inoculação não diferindo da testemunha (Figura 3). É importante ressaltar que a elevação do teor de proteínas pode estar relacionada à síntese de proteínas-RP que auxiliam a planta na indução da RSA (KUHN, 2007). Resultados semelhantes a este trabalho foram encontrados por Borsatti et al. (2015) utilizando 1,0 mM de ácido salicílico em pós colheita de amora preta atingiram o pico do teor de proteínas 24 h após a aplicação.
Inagaki et al. (2011) ao aplicarem extratos de folhas de alho (Allium sativum) na superfície dos cotilédones de pepino e após dois dias inocularam suspensão de conídios de Coletotrichum orbiculare, observaram que ocorreu incidência de antracnose nos cotilédones tratados com o extrato ao se comparar com a testemunha, conferindo assim a indução de resistência da cultura contra o patógeno.
Tabela 7 - Teor de proteína (mg g-1 tecido), atividade da enzima quitinase (U.E mg-1 proteína-1)
e atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (FAL) (Uabs min-1mg-1proteína-1 x 10-2)
presente em pêssegos tratados em pós-colheita com extrato aquoso de alho, arruda, carqueja e nim em função do tempo de avaliação (*).UFFS, Erechim/RS, 2016.
Extratos 24 Tempo (horas)48 72
Teor de proteína (mg g-1 tecido)
Testemunha 0,51 cA 0,55 aA 0,33 Aa Alho 2,29 abA 0,97 aB 0,96 aB Arruda 1,64 bA 0,93 aAB 0,40 aB Carqueja 2,99 aA 1,16 aB 0,58 aB Nim 2,48 abA 1,50 aB 0,82 aB CV (%) 42,98
Quitinase (U.E mg-1 proteína-1)
Testemunha 0,47 bA 0,62 bA 0,45 cA
Alho 1,92 aA 1,34 abA 1,69 bA
Arruda 0,61 bC 1,71 aB 2,99 aA
Carqueja 0,22 bB 0,51 bB 1,66 bA
CV (%) 44,11 FAL (Uabs min-1mg-1proteína-1 x 10-2)
Testemunha 1,5 aA 1,4 cA 1,4 cA
Alho 3,2 aC 9,2 aA 6,8 aB
Arruda 2,3 aA 4,1 bA 3,1 bcA
Carqueja 1,3 aB 6,0 bA 5,2 abA
Nim 1,6 aA 3,5 bcA 3,3 bcA
CV (%) 34,17
*Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey a 5% de significância.
FONTE: Elaborado pelo autor.
Para as proteínas-RP avaliou-se a atividade da quitinase e β-1,3-glucanase, sendo que esta última não apresentou atividade, fato que pode estar relacionado a característica do patógeno M. fructicola, o qual pertence ao filo Ascomycota, e sua parede celular ser constituída de quitina e β-glucanas (MASSOLA; KRUGNER, 2011). E nesse sentido, o processo de defesa nesse patosssitema ser priorizado para síntese de quitinase, fato já observado em outros trabalhos.
O extrato de alho demonstrou potencial na ativação da enzima quitinase, já nas primeiras 24 h após a aplicação do patógeno, onde ocorreu o pico de atividade da enzima, sendo que tal atividade, manteve-se diferindo dos demais extratos durante as 72 h. O extrato de arruda diferiu da testemunha após 48 h, sendo que seu pico ocorreu as 72 h, quando ocorreu a maior a ativação chegando a 85% comparada a testemunha, sendo maior que os demais extratos. Observou-se que nos extratos de arruda e carqueja a atividade da quitinase aumentou conforme passou o período de aplicação (Tabela 7). Segundo Labanca (2002) as enzimas hidrolíticas, como a quitinase quebram polímeros estruturas da parede celular do fitopatógeno e tem sua atividade estimulada quando são aplicados indutores de resistência nos frutos ou plantas.
Naz et al. (2014) aplicaram extrato aquoso de Jacaranda mimosifolia, Colotropis procera e Thevetia peruviana em folhas de trigo para proteger contra Puccinia triticina, e observaram que a incidência da ferrugem foi menor quando os extratos foram aplicados antes da inoculação do fungo, estimulando a expressão de genes relacionados a defesa, como quitinase, β-1,3-glucanase e FAL.
Além da atividade da quitinase como indicador de RSA, a atividade da fenilalanina amônia-liase (FAL), também tem função na indução de resistência, pois esta enzima catalisa a desaminação da fenilalanina para formar trans-cinamato, este por várias reações se converte
em ácido salicílico que é a molécula sinalizadora, pois é responsável pela ativação das funções que expressam a resistência contra o patógeno (CAVALCANTI et al., 2005). Segundo Hennig et al. (1993) o ácido salicílico pode ser convertido em composto volátil metil salicilato e se deslocar para ativar a resistência em locais próximos na planta que não foram inoculadas. Ainda a FAL possui ação na rota dos fenilpropanóides para formação de compostos fenólicos, entre eles as fitoalexinas, moléculas importantes na defesa de patógenos. Bem como a síntese de lignina, a qual está relacionada a resistência mecânica no processo de defesa (NAKAZAWA et al., 2001).
Dessa forma pode-se observar que a atividade da FAL as 24 h não diferiu entre os extratos e a testemunha. Porém as 48 h a FAL foi induzida pelo extrato de alho, obtendo seu pico que foi de 84,8% em relação a testemunha nesse período, diferenciando dos demais extratos em toda a análise. Para o extrato de arruda não ocorreu aumento da atividade com o decorrer do tempo, enquanto que para o extrato de carqueja e nim a atividade da FAL aumentou das 24 h para as 48 h, porém não diferiu para as 72 h (Tabela 7). Mazaro et al. (2013) também observaram a estimulação da atividade da FAL, quando aplicaram extrato alcoólico, infusão e maceração de Calendula officinalis em pós-colheita de morangos.
4.4 CONCLUSÃO
Os extratos avaliados possuem potencial de induzir a resistência dos frutos à podridão parda, ativando as enzimas quitinase e fenilalanina amônia-liase. No entanto, o extrato de alho, além de demonstrar destacável potencial de ativar tais mecanismos de defesa, atua na redução da podridão de frutos de pêssego causada por Monilia fruticula.
AGRADECIMENTO
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pela concessão da bolsa de estudo.
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