CHAPITRE IV TRAITEMENT D’IMAGES FLUORESCENTES DE HAUTE DENSITE
ANNEXE 1 COMPTAGE DE PHOTONS UNIQUES CORRELES EN TEMPS
La fluorescence résolue en temps par comptage de photons uniques TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting) est une technique qui nécessite l'utilisation de lasers pulsés générant des impulsions de très courtes durées (quelques dizaines de femtosecondes). Ces impulsions induisent le peuplement des niveaux excités des molécules fluorescentes présentes dans les échantillons. Vient ensuite une désexcitation de ces niveaux produisant, en partie, une émission de fluorescence. La façon la plus simple de suivre ce déclin de fluorescence consisterait à suivre le flux de lumière émis dans le temps à l'aide d'une électronique ultra-rapide. Cependant la résolution temporelle requise est difficile à atteindre avec les équipements traditionnels, tel qu'un oscilloscope rapide par exemple. De plus, la quantité de photons émise est trop faible pour générer un signal représentatif du flux de lumière.
Le principe de la technique du comptage de photons uniques corrélés en temps repose sur le fait que la probabilité de détecter un photon de fluorescence à l’instant t, après l’impulsion d’excitation, est proportionnelle à l’intensité de fluorescence à cet instant. Concrètement, une expérience en TCSPC commence avec la détection du pulse laser réalisée à l'aide d'une photodiode ou directement d'un signal de sortie fourni par le laser (trigger), définissant un temps zéro (START). A partir de cette référence temporelle, le système déclenche un « chronomètre » jusqu'à la détection du premier photon par le détecteur placé sur le trajet optique de la fluorescence. Au premier photon détecté, le chronomètre s'arrête (STOP) et le temps 𝛥t mesuré est enregistré. La démarche est ensuite reproduite pour chaque pulse laser afin d’accumuler les temps des différents événements.
Figure 85 : Schéma de détection d’un photon (évènement) suivant la méthode TCSPC. Adaptée de
[155].
L'émission d'un photon de fluorescence est un phénomène probabiliste et indépendant. Lorsqu'un grand nombre d’événements est enregistré, il devient possible de reconstruire statistiquement un déclin et d'obtenir la courbe qui aurait été obtenue par le suivi analogique du signal.
Figure 86 : Schéma du déclin de fluorescence reconstruit sur la base des événements enregistrés.
Adaptée de [155].
La détection d'un photon par le détecteur induit un temps-mort (𝛥tmort) pendant
lequel le système est inopérant. Ce phénomène est susceptible de fausser la statistique de comptage. En effet, si deux photons sont émis pendant la période de mesure, seul le premier sera pris en compte (effet pile-up). Pour éviter ce biais, la puissance du laser sur l'échantillon
Pulse laser Photon de fluorescence START STOP t1 t2 Ev èn em en ts Temps (ns)
doit être choisie afin de limiter la probabilité d'émission de deux photons dans la période de mesure ainsi que le nombre d’impulsions laser faisant l'objet d'une détection. Ce nombre d’impulsions est choisi en fonction du temps mort du détecteur généralement fixé dans un intervalle de 1 à 2 %.
Figure 87 : Schéma représentant le temps mort du détecteur à l’origine de l’effet pile-up. Adaptée de [155].
Il faut noter que le déclin de fluorescence n'est pas directement obtenu par cette technique. En effet le signal mesuré correspond en fait à la convolution du déclin avec la réponse instrumentale de l'appareil (IRF). En pratique, il est préférable d’acquérir préalablement l’IRF à l’aide d’une solution diffusante (sans émission de fluorescence) afin de déconvoluer le signal de fluorescence obtenu sur les échantillons. L’IRF est sensible aux réglages du montage expérimental et dépend de la qualité de l’alignement du faisceau optique.
L’émission de fluorescence depuis l’état S1 suit une loi du premier ordre. La durée de
vie de fluorescence d’un composé est dépendante de son environnement. C’est pourquoi les temps de vie caractéristiques des composés de références sont toujours donnés en solution, pour un solvant spécifique et à température ambiante. Généralement, l’émission de
fluorescence d’un composé seul en solution décroit de façon mono-exponentiel. Cependant, la présence de plusieurs espèces (excimère, agrégation de molécules…) ne permet
généralement pas la modélisation du signal par un déclin mono-exponentielle. Dans de tels cas, une modélisation par une somme d’exponentielles a été choisie.
Pulse laser
t
mort Photon non détecté Photon non détecté𝐼(𝑡) = ∑ 𝐴𝑖𝑒−𝑡τ𝑖
𝑖
(34)
Où I correspond à l’intensité de fluorescence mesurée, A au coefficient préexponentiel et τ au temps de vie de fluorescence. Les paramètres Ai et τi sont alors déterminés suivant la
méthode des moindres carrés non linéaire [156]. La valeur du 𝝌2 permet de juger de la qualité du modèle mathématique appliqué au déclin. Une valeur pratique traduisant la bonne qualité de la modélisation sera généralement comprise entre 0.8 et 1.2. Les temps de vie ainsi trouvés sont donnés pour une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une polarisation à l’angle magique (54,7 °). Les déclins ont été traités respectivement via le logiciel FluoFit version 4.6.6et le logiciel SymPhoTime version 2.1 de PicoQuant.
Afin de valider le montage expérimental, la mesure de la Coumarine 153, une molécule standard [157] dont le temps de vie en solution dans le méthanol est connu (𝜏 = 4,3 ± 0,2 ns) a été réalisée (Figure 88). Une valeur de 4 ± 0,2 ns a été trouvée avec l’utilisation d’un modèle mono-exponentiel (χ² = 0,997) et avec déconvolution du déclin par l’IRF expérimentale.
Figure 88 : Déclin de fluorescence et ajustement avec une fonction mono-exponentielle de la
Coumarine 153 dans le méthanol. La qualité des ajustements est représentée par leurs résidus pondérés. 100 101 102 103 104 Nom b re d e c o u p s 25 20 15 10 5 0 Coumarine153 (eau) IRF ² = 0.997 -5 0 5 Rés id u s p o n d é ré s 25 20 15 10 5 0 Temps (ns)