2.3.1 Le sang
Le sang est un des liquides biologiques les plus analysés du fait de sa pratique courante dans la prise en charge habituelle des patients. Dans le cadre de la recherche de biomarqueurs, le sang prélevé doit être traité rapidement par centrifugation pour obtenir le sérum ou le plasma. Le plasma est obtenu après collection du sang dans un tube contenant un anticoagulant (de type héparinate, EDTA ou citrate). Le sérum est quant à lui obtenu après coagulation du sang collecté
54 dans un tube, sans anticoagulant (Hu, Loo, et Wong, 2006). Le sérum possède globalement la même composition que le plasma, en dehors du fait qu’il ne contient plus de fibrinogène (suite à la coagulation du sang) (Anderson et Anderson, 2002). Parfois utilisé de manière interchangeable dans les essais concernant les biomarqueurs, l’HUPO (Human Proteome Organization) standardise les étapes pré-analytiques pour les études protéomiques et recommande l’utilisation du plasma (Omenn et al., 2005). En effet, l’analyse du plasma s’est révélée plus reproductible que celle du sérum du fait de la variabilité du processus de coagulation. Il est cependant à noter que pour certaines études rétrospectives, l’utilisation du sérum était la seule possibilité d’étude car le plasma est moins souvent stocké dans les biobanques (Omenn et al., 2005).
Les protéines sériques ou plasmatiques peuvent être classées en trois groupes :
1) Les protéines secrétées, qui peuvent exister sous plusieurs formes (en moyenne en 3 variantes) avec pour chacune des possibilités de clivage et de modifications post-traductionnelles différentes. La moitié de la masse protéique est représentée par une seule protéine, l’albumine qui est présente à une concentration d’environ 55 g/L chez l’adulte. Avec les 10 autres protéines les plus abondantes, ces protéines majoritaires constituent 90% de la masse protéique totale. En revanche, parmi les protéines de l’inflammation, les cytokines, par exemple l’interleukine-6 (Il-6) est présente à des concentrations de l’ordre de 1 à 5 pg/mL, soit un facteur 108 de différence par
rapport à l’albumine.
2) Les protéines non secrétées, provenant du renouvellement des cellules des tissus, se retrouvent également sous différentes formes dans la circulation sanguine et à de faibles concentrations.
3) les immunoglobulines, près de 10 000 000 immunoglobulines différentes, sont présentes dans la circulation sanguine et reflètent « l’histoire » immunologique de chaque individu (Anderson, 2005).
Le sérum et le plasma sont donc caractérisés par une énorme variabilité dans le type de protéines, accompagnée d’une grande gamme dynamique en concentration de l’ordre de 1010.
55 2.3.2 Les urines
L’urine est un liquide biologique très utilisé pour la recherche de biomarqueurs du fait de sa collection non invasive et en grande quantité. De plus, des études de profilage ont montré que le protéome urinaire était stable lorsque les urines sont conservées à 4°C jusqu’à trois jours (Schaub et al., 2004 ; Theodorescu et al., 2006).
Les urines contiennent des protéines solubles et un sédiment (phase solide).
1. Les protéines solubles urinaires proviennent en grande partie de la filtration du sang par le glomérule rénal. Les peptides et petites protéines (10 kDa) du sang circulant filtrent librement à travers le glomérule, tandis que celui-ci retient efficacement les protéines de haut poids moléculaire (>60 kDa). Cependant, dans certaines conditions physiologiques, une fraction de protéines abondantes du sang (comme l’albumine ou les immunoglobulines) parvient à traverser le glomérule rénal et est ensuite réabsorbée dans le tubule contourné proximal du rein (Christensen et Birn, 2001). Une modification dans la concentration urinaire des protéines peut alors résulter d’une variation de sa concentration sanguine, de sa filtration glomérulaire, ou de son processus de réabsorption dans le tubule proximal. Ces variations peuvent révéler différents processus pathologiques dans l’organisme en général (maladie systémique) ou au niveau du rein (maladie glomérulaire ou tubulaire, etc). Une étude a ainsi montré que sur les protéines retrouvées dans les urines, 49% sont des protéines solubles (H. Zhou et al., 2006).
2. Certaines des protéines solubles sont issues des cellules rénales. Par exemple, la THP (Tamm-Horsfall protein ou uromoduline) est une protéine issue du clivage protéolytique de son précurseur membranaire qui est exprimé dans la branche ascendante large de l’anse de Henlé où il se localise dans la membrane apicale des cellules tubulaires (Serafini-Cessi, Malagolini, et Cavallone, 2003). La THP est généralement la protéine urinaire la plus abondante, et par conséquent, elle peut interférer avec la détection d’autres protéines si elle n’est pas préalablement éliminée.
3. La phase solide des urines est constituée principalement de sédiments de haute densité composés de cellules épithéliales nécrosées et de cylindres urinaires, qui peuvent être isolés par des centrifugations à basse vitesse. Une augmentation du nombre de cellules ou des cylindres
56 peut être indicative de maladie rénale, et leur identification par microscopie optique peut être informative pour le diagnostic. Une autre partie de cette phase solide correspond à des débris membranaires ou petits fragments de membrane (ou des corps apoptotiques ?) issus de la desquamation des microvillosités ou de processus d’apoptose. Cette fraction insoluble peut être isolée par des centrifugations à vitesse moyenne, autour de 17 000 g (Vaidyanathan, 2015).
4. Cette phase solide des urines contient également des exosomes qui peuvent être isolés par des ultracentrigfugations (Pisitkun, Shen, et Knepper, 2004). Les exosomes urinaires représentent 3% des protéines urinaires et sont issus de l’ensemble des cellules du tractus urinaire (H. Zhou et al., 2006).
2.3.3 Lavage Broncho-alvéolaire
Les lavages broncho-alvéolaires (LBA) sont collectés par lavage des lobes pulmonaires avec une solution saline au cours d’une fibroscopie bronchique. Le liquide recueilli est alors centrifugé pour obtenir un surnageant débarrassé des cellules et débris cellulaires (Meyer et al., American Thoracic Society Committee on BAL in Interstitial Lung Disease, 2012).
Le LBA est un mélange complexe des protéines provenant des cellules épithéliales ou de la diffusion (passive ou active) à travers la barrière alvéolo-capillaire (Nguyen et al., 2014). Les protéines les plus abondantes dans le LBA sont des protéines plasmatiques (par exemple : albumine, transferrine, alpha 1-antitrypsine, immunoglobulines A et G) qui peuvent provenir d’une diffusion à travers la barrière alvéolaire air-sang (Bell et al., 1981). La plupart des maladies pulmonaires interstitielles sont caractérisées par une augmentation du passage des protéines plasmatiques dans le LBA suite à une perméabilité accrue de la barrière par lésion ou inflammation (Bowler et al., 2004 ; Noël-Georis et al., 2001).
Le LBA contient également des protéines associées au surfactant pulmonaire (SP-A, SP-B, SP-D), des protéines des cellules de club (CC-16, CC-10) et des antigènes associés aux mucines qui sont principalement sécrétées par les cellules des voies respiratoires et les cellules épithéliales alvéolaires (Hermans et Bernard, 1999).
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