Composés amine 13 (amine/PaPBGS) et thioéther 14 (thioéther/PaPBGS)

La résolution des structures de la PBGS complexée avec les composés amine 13 et thioéther 14, a révélée une surprise. Les deux inhibiteurs sont liés au site actif via des bases de Schiff avec leurs deux groupements cétones et les lysines du site A (Lys205) et du site P (Lys260) respectivement. De plus, dans les deux cas, les structures révèlent une densité électronique continue connectant les carbones 3 et 8 de l’inhibiteur, indiquant la formation d’une liaison C- C entre ces deux atomes, en parfaite analogie avec la réaction catalytique naturelle (HFigure 134 et HFigure 135). La formation de la nouvelle liaison C-C entraîne la cyclisation de l’inhibiteur, ce qui a pour conséquence le rapprochement des deux lysines. Néanmoins aucun réarrangement significatif des résidus environnants n’est observé, lorsque les structures sont comparées avec les structures 5-OH-LA/PaPBGS, 5-F-LA/PaPBGS [46] et ALA/ScPBGS [43]. Au lieu de cela, la partie apolaire de l’inhibiteur dans le site P change sa conformation, excepté le groupe carboxylate qui reste fixé dans sa position. Pour la même raison la position du groupe carboxylate du site A est légèrement déplacée dans les deux structures, montrant ainsi la plus grande flexibilité de reconnaissance du site A par rapport au site P. Cette observation est compatible avec la séquence de reconnaissance : le substrat est reconnu dans le site P en premier par conséquent le substrat est lié plus fortement dans cette partie du site actif.

Figure 134 : Composé amine 13 co-cristallisé avec la PBGS. L’inhibiteur, en jaune, est lié à la Lys205 du site A via une base de Schiff et à la Lys260 du site P via une liaison simple. La réaction d’aldolisation entre le carbone 3 et 8 de l’inhibiteur a crée une nouvelle liaison qui est représentée par une densité électronique (en bleu) continue entre les deux atomes de carbone. Le résidu aspartate (D139) montre deux conformations. Les résidus environnants sont colorés en gris et les molécules d’eau sont représentées par des sphères rouges

S286 V285 Y211 Q233 K229 K205 K260 M177 D139 D131 Y202 S175 D127 F86 F214 Y283 Y324 S286 V285 Y211 Q233 K229 K205 K260 M177 D139 D131 Y202 S175 D127 F86 F214 Y283 Y324

Figure 135 : Composé thioéther 14 co-cristallisé avec la PBGS. L’inhibiteur, en vert, est lié à la Lys205 du site A via une base de Schiff et à la Lys260 du site P via une liaison simple. La réaction d’aldolisation entre le carbone 3 et 8 de l’inhibiteur a crée une nouvelle liaison qui est représentée par une densité électronique (en bleu) continue entre les deux atomes de carbone. Les résidus environnants sont colorés en gris et les molécules d’eau sont représentées par des sphères rouges

Dans le site A, l’inhibiteur est lié à la Lys205 via une base de Schiff, tandis que dans le site P, il est lié à la Lys260 via une liaison simple. Les deux inhibiteurs sont stabilisés grâce à des interactions hydrophobes avec les résidus Met177, Ala204, Tyr211, Phe214, Tyr283, Val285 et Ser286. Le groupe carboxylate dans le site P est reconnu par des liaisons hydrogène avec les résidus Ser286 et Tyr324. Ces interactions sont typiques de ce qui est observé dans toutes les PBGS qui fixent un ligand dans le site P. Le seul changement observé dans nos deux structures, comparé avec toutes les structures des PBGS qui lie un ligand dans le site P, est la configuration de la partie apolaire (carbones 7 à 10) qui est différente. Cette partie s’adapte ainsi à la formation de la nouvelle liaison C-C. Le groupe carboxylate du site A interagit avec les résidus Arg215, Lys229, Gln233. Ces interactions sont également observées dans toutes les structures des PBGS qui fixent un ligand dans le site A. Dans ces deux nouvelles structures, amine/PaPBGS et thioéther/PaPBGS, une molécule d’eau vient compléter le réseau d’interactions du groupement carboxylate du ligand dans le site A. Cette molécule d’eau fait partie d’un environnement hydrophile (dans le site A) incluant les résidus Asp131, Asp139 et Ser175 et une molécule d’eau supplémentaire. La seule différence entre les deux structures amine/PaPBGS et thioéther/PaPBGS provient de la nature différente de l’atome centrale du ligand. Le groupement sulfure de la structure thioéther/PaPBGS est capable de jouer un rôle d’accepteur de liaisons hydrogène. Cependant cette fonction ne participe pas à la formation de ces liaisons dans le site actif de l’enzyme. Par contre, la fonction centrale amine de la structure amine/PaPBGS forme des liaisons hydrogène avec une des deux molécules d’eau présentes au site actif de la PBGS. Comme l’accepteur de liaisons hydrogène sulfure de 14 ne forme pas de liaisons hydrogène, alors que l’amine de 13 est capable d’en former, cela laisse supposer que la fonction amine joue un rôle de donneur de liaisons hydrogène et pourrait donc se trouver sous sa forme protonée, cela veut dire que ce groupe devrait être

S286 V285 Y211 Q233 K229 K205 K260 M177 D139 D131 Y202 S175 D127 F86 F214 Y283 Y324 S286 V285 Y211 Q233 K229 K205 K260 M177 D139 D131 Y202 S175 D127 F86 F214 Y283 Y324

hypothèses de départ : les substrats et les inhibiteurs sont liés au site actif dans un état de protonation (ou de déprotonation) qui correspond au pH de la solution et au pK de ces groupes fonctionnels en solution. Ainsi l’hypothèse d’un réseau de liaisons hydrogène est envisageable entre la forme protonée de l’amine de 13, une molécule d’eau et la forme déprotonée d’un groupement carboxylate d’un acide aspartique présent au site actif.

Ces deux structures très semblables, amine/PaPBGS et thioéther/PaPBGS, sont à nouveau une bonne indication que nous sommes en présence d’un résultat significatif. La configuration des deux ligands ainsi que les interactions hydrophiles et hydrophobes sont identiques pour les deux structures. La seule différence provient de la fonction centrale (linker) des ligands. Contrairement au groupement sulfure de 14, l’amine secondaire de 13 forme une liaison hydrogène supplémentaire avec une des deux molécules d’eau présente au site actif de l’enzyme. Ces deux structures sont donc des modèles, où la formation de la liaison C–C par une réaction du type aldol entre les deux molécules de substrat s’est produite avant que la base de Schiff formée avec la lysine du site A (Lys205) ne soit détruite par l’attaque du groupement amino du substrat du site P. Un tel intermédiaire a été trouvé dans la structure d’un mutant F12L de la PBGS humaine co-cristallisé avec ALA 5 (intermédiaireII/HsPBGS) [91]. Cet intermédiaire II est obtenu par la formation de la liaison C–C entre les deux molécules ALA 5 qui sont fixées via des bases de Schiff au site A et P respectivement. La conformation de la partie supérieure (carbones 1 à 4 du site A et P) de cet intermédiaire I ressemble de manière étroite à la conformation des parties correspondantes (carbones 1 à 4 et carbones 8 à 11) des composés amine 13 et thioéther 14. Cette observation souligne ainsi le bien-fondé de ces inhibiteurs dans leur capacité à imiter les intermédiaires de réactions. La

H

Figure 136 montre la superposition de la structure intermédiaireII/HsPBGS [91] avec la structure amine/PaPBGS.

Figure 136 : Superposition de la structure intermédiaireII/HsPBGS [91], en cyan, avec la structure amine/PaPBGS. L’intermédiaire II est issu de la formation de la liaison C-C entre deux molécules de substrat naturel et est lié dans le site A et P via des bases de Schiff. L’ion zinc provenant de HsPBGS est représenté par une sphère cyan. Dans la structure intermédiaireII/HsPBGS, quelques résidus sont manquants parce que le site actif est partiellement désordonné

S286 V285 Y211 Q233 K229 K205 K260 M177 D139 D131 Y202 S175 D127 F86 F214 Y283 Y324 S286 V285 Y211 Q233 K229 K205 K260 M177 D139 D131 Y202 S175 D127 F86 F214 Y283 Y324

Un second intermédiaire a également été stabilisé dans le site actif de la PBGS. Il s’agit de l’intermédiaire de réaction cyclique stabilisé dans le site actif de la PBGS de levure co- cristallisée avec le substrat naturel ALA 5 (intermédiaireI/ScPBGS) [90], soulignant ainsi le caractère des inhibiteurs à former des intermédiaires de réaction cycliques stables. Les liaisons C-C et C-N sont formées entre les deux molécules ALA 5, et l’intermédiaire I ainsi formé est lié de manière covalente à la lysine du site P (Lys260) uniquement. La configuration des deux ligands dans le site P et dans le site A est différente, excepté pour les deux groupes carboxylates qui sont positionnés de manière identique. La HFigure 137 montre la superposition de cette structure intermédiaireI/ScPBGS avec la structure thioéther/PaPBGS.

Figure 137 : Superposition de la structure intermédiaireI/ScPBGS [90], en beige, avec la structure thioéther/PaPBGS. L’intermédiaire I est issu de la formation des liaisons C-C et C-N entre deux molécules de substrat naturel et est lié dans le site P uniquement, de manière covalente avec la Lys260. L’ion zinc provenant de ScPBGS est représenté par une sphère cyan

Les deux groupes carboxylates de chacune des deux structures, sont reconnus au même endroit autant dans le site P que dans le site A. La différence est que dans une des structures un cycle à 5 est lié à une base de Schiff uniquement dans le site P (intermédiaireI/ScPBGS) tandis que dans l’autre structure un cycle à 6 est lié via deux bases de Schiff (thioéther/PaPBGS). Les deux positionnements des cycles engendrent une configuration différente des deux ligands dans le site P. De plus, ces deux configurations sont différentes de ce qui est observé lorsque un analogue de substrat est lié dans ce site P.